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文档简介

1、cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE),张晓玲,技术背景 基本RACE 原理和方法 样品要求 RACE 产物的鉴定和全长 cDNA 的获得,基本RACE原理,技 术 背 景,得到某基因的片段、全长或近全长cDNA的方法： 建立和筛选cDNA 和DNA 文库。 利用GenBank 数据库中的表达序列标签(express sequence tags , ESTs) 拼接出全长或近全长cDNA 。 是多聚酶链式反应即PCR。 cDNA 末端快速扩增(RACE) 技术。,基本RACE 原理和方法,利用Oligo (dT) 对mRNA 进

2、行反转录的同时在两头加上通用接头(引物) ， 从而可利用基因特异的引物 (gene specific primer，GSP) 通过PCR 反应快速获得 目的序列的5端和 3端。,RACE流程,5-RACE法原理图,（1） （2） （3） （4）,RNase H,样品要求： 提取Total RNA的材料要新鲜，采样后立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂。 Total RNA无降解，OD260/280=1.8 2.0。 提供尽量多的实验材料：3 RACE Total RNA15 g；5RACE Total RNA25 g。如果基因的含量较低或者未知序列较长，样品量需相应增加。,RACE 产物的鉴定和

3、全长 cDNA 的获得,3或5双链cDNA,限制性内切酶酶切,Southern blot 分析,克隆,3和5重叠序列的连接,RACE 产物的3和5 末端序列的分析,合成相应引物,PCR获得全长cDNA,SMART RACE cDNA synthesis Kit,SMART RACE cDNA synthesis Kit,碱基互补 配对原则,AT之间 形成两个氢键 GC之间 形成三个氢键,poly(C)替代poly(A) 增加5 接头与cDNA 第一链的结合牢固性,增加模板中有效双链丰度,提高目的基因获取几率,SMART RACE cDNA synthesis Kit原理,cDNA第一链的合成机

4、制,SMARTer RACE流程,5 RACE流程图,3 RACE流程图,GSP 与 cDNA 模板的关系,GSP 要求： 2328 nt 5070% GC Tm 65；降落式（touchdown）PCR，Tm 70 与通用引物的 3-末端不互补,GSP 与 cDNA 模板的关系,GSP1：5-RACE PCR的反义引物 GSP2：3-RACE PCR的正义引物,合适的酶切位点,100200bp,注意：GSP1与GSP2的Tm值要相似,GSP 与 cDNA 模板的关系,NGSP：槽式（Nested）PCR引物,扩增后的预期：,具体实验方法,cDNA第一链的合成 阳性对照RACE PCR实验 cDNA末端的快速扩增 RACE产物鉴定 试剂盒试剂,比较用GSPs和NGSPs引物获得的PC

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