中药化学成分的一般研究方法

1、主要内容,一、中药化学成分类型,第一节 中药化学成分简介,中药化学成分类型,苷类,萜类和挥发油,生物碱,鞣质,糖及糖的衍生物,苷元,单糖,低聚糖,多糖,醌类,苯丙素类,黄酮类,甾体类,三萜类,（一）糖类 分为单糖、低聚糖、多糖及其衍生物。,注：单糖、低聚糖易溶于水，难溶于醇。多糖大多不溶于水，更难溶于醇。,葡萄糖,鼠李糖,蔗糖,麦芽糖,红景天苷,（二）苷类,基本骨架：C6-C3，典型化合物：香豆素和木脂素类。 1. 有一内酯结构，碱水解开环， 加酸闭环。 2. 游离亲脂性；成苷后水溶性增大。,香豆素,木脂素,（六）甾体,（七）三萜类化合物,（2）溶解性 游离萜类亲脂性。 萜类苷化亲水性。 具有

2、内酯结构的 碱开环，酸闭环 （与？性质类似）,比如：当归、肉桂、鱼腥草、薄荷、姜等均含有挥发油。,烟碱,（十）鞣质（鞣酸）,二、生物合成 （一）一次代谢产物及二次代谢产物 1、一次代谢产物 是植物机体生命活动不可缺少的物质，如蛋白质、脂肪、糖、核酸等。 2、二次代谢产物 是植物机体生命活动非必需的物质，多数是植物代谢的排泄物。如生物碱、黄酮、皂苷等。 （二）生物合成假说的提出 天然化合物的分类，结构相似意味着生物合成上可能为同一起源，为生物合成假说的提出奠定基础。如依C数不同的分类，1887年异戊二烯法则。随着分析手段发展，修改了异戊二烯法则，1956年发现了甲戊二羟酸途径。,（三）主要的生物

3、合成途径（5条） 1、醋酸-丙二酸途径 合成：脂肪酸类、酚类、蒽酮类等。 2、甲戊二羟酸途径 合成：萜类、甾体类。 3、桂皮酸途径及莽草酸途径 莽草酸苯丙氨酸桂皮酸（途径） 苯丙素类 4、氨基酸途径 合成：生物碱。,5、复合途径 天然化合物均来自2个以上的不同生物合成途径。 （1）醋酸-丙二酸莽草酸途径 （2）醋酸-丙二酸甲戊二羟酸途径 （3）氨基酸醋酸-丙二酸途径 （4）氨基酸莽草酸途径 （5）氨基酸甲戊二羟酸途径,第二节 中药有效成分的提取分离方法 引言 1 提取：利用适当的溶剂或方法，将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。即去粗取精的过程。 2 分离：把提取物中所含的各种成分一一分开，

4、最后把得到的单体加以精制的过程。,一、中药化学成分常用的提取方法,常用的提取 方法,溶剂提取法,水蒸气蒸馏法,升华法,原理：相似相溶,注：溶剂提取法包括超临界流体提取法,（一）溶剂提取法,掌握三个方面内容,扩散 渗透 溶解,经典5种 现代5种,经典：浸渍法、渗漉法、煎煮法、 回流提取法、连续回流提取法 现代：超声提取法、超临界提取法。 还包括微波提取法，酶解提取法，半仿生提取法,有机溶剂分为三类:,亲水性有机溶剂,水,与溶剂的结构有关，常见溶剂极性强弱顺序：(P21): 石油醚、四氯化碳、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、 水,亲脂性有机溶剂,4.常见的溶剂种类,问1：根据相

5、似相溶原理，那这三种类型试剂分别能提取什么成分？,中药化学成分的提取溶剂法,Step 2,Step 3,氯仿或乙酸乙酯 游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素的苷元,丙酮或乙醇、甲醇 苷类、生物碱盐、鞣质,水 氨基酸、糖类、无机盐,Step 4,掌握常见溶剂提取方法、实用范围及优缺点,溶剂法提取,超临界萃取法,渗漉法,煎煮法,回流提取法,连续回流提取法,浸渍法,超声提取法,经典提取方法,现代提取方法,浸渍法,样品置溶剂里，室温下或温热（6080）浸泡一段时间的提取方法,适宜易溶出的组分 适宜遇热不稳定的成分或含大量淀粉、粘液质等的中药 费时（8 24小时）,特点,渗漉法,渗漉装置,不断加入新溶剂，使

6、浸出液从下端流出，造成浓度差，以提高浸出效果。 溶剂消耗大，费时。,煎煮法,中药材中加入水后，加热煮沸，将有效成分提取出来。,简便 不适宜遇热不稳定的成分或含挥发性的成分 水回收难,特点,回流提取法,样品置有机溶剂中加热回流的提取方法,加快溶出速度，省时 不适宜热不稳定的药物 适宜较难溶出的组分,特点,仪器,普通回流装置,通过更换溶剂，使提取更完全,溶剂回流提取装置 1圆底烧瓶； 2冷凝管,连续回流提取法,样品置有机溶剂中加热，蒸发的溶剂经冷凝流回样品管的提取方法,节省溶剂，提高提取效率 提取液始终处在溶剂沸点温度下，不适于热不稳定组分的提取。 费时,特点,仪器,索氏提取器,索氏提取装置,一种

7、较新的技术，以超声波振荡加速组分的溶解和扩散过程，提高提取效率和速度 利用超声的空化作用对细胞膜的破坏，有助于有效成分的溶出与释放，溶质的扩散 超声使水温在57度左右，对原料有水浴作用 提取速度快、时间短、收率高,超声提取,应用示例：鼻炎片中木兰脂素的含量测定 中国药典2005，一部 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率150W，频率25kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，加在已经处理的中性氧化铝柱（100200目，2g，内径10mm，湿法装柱，用

8、甲醇预洗）上，用甲醇适量洗脱，收集洗脱液至10ml量瓶中，收集近10ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过取续滤液即得。 吸取供试品溶液20微升注入液相色谱仪即可。,超临界流体提取法（SFE） （1）定义：采用超临界流体为溶剂对天然药物进行提取的方法称为超临界流体萃取法。超临界流体是物质处于其临界温度和临界压力以上状态时，成为单一相态，此时的物质称为超临界流体。,超临界流体 液体 气体 密度(g/ml) 0.2-0.9 0.6-1.6 (0.6-2.0)10-3 扩散度(cm2/s) (0.2-0.7)10-3 (0.2-3.0)10-5 0.1-0.4 粘度(g/cm.s) (2.0-9.9)10-

9、4 (0.3-2.4)10-2 (0.5-3.5)10-4,超临界流体的性质如密度、粘度和扩散性等处于气体和液体之间，而且与温度、压力和流体组成有关。,超临界流体的性质 超临界流体同时具有液体和气体的双重特性。 a.SCF具有气体的低黏度和扩散系数（比液体大近100倍），表面张力接近零。 b.SCF又有液体的高密度（对溶质的溶解度大）因而具有良好的传质和渗透性能，对许多物质有很强的溶解和萃取能力，可作为溶剂进行萃取或分离单体。,超临界流体的选择 最常用的流体物质：二氧化碳。 还有一氧化二氮、氨、乙烷、庚烷、二氯二氟甲烷等。,超临界流体CO2 优点： 性质稳定，使用安全，价格低廉，临界点低(Tc

10、=31，Pc=7.37MPa)，易于操作 在临界点附近温度或压力的改变会使密度(P)发生较大的变化，同时使许多物质在其中的溶解度(S)也发生变化,缺点：CO2是非极性物质 a.对亲脂性的成分，如挥发油、醚、酯类等易萃取。 b.化合物极性基团多，极性 ，萃取就难。 因此在SFE-CO2萃取中常加入夹带剂来解决。,夹带剂：作为“亚临界组分” 夹带剂的作用根据夹带剂极性不同，提 取不同极性成分，扩大提取成分的种类。 常用夹带剂种类一般情况下，具有很好溶解性能的溶剂，也往往是很好的夹带剂。如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈。,超临界流体萃取法的技术优势,CO2萃取过程不发生化学反应, 不燃性气体，无味、无臭、无

11、毒，安全性好； CO2价格便宜，纯度高，容易取得，在生产过程中循环使用，降低成本； 样品易浓集；,具有与液体相似的较强的溶解能力； 传质快，提取时间短； 超临界流体的表面张力为零，易渗透到样品中，带走测定组分； 该技术易与其他仪器联用实现自动化。,（二）水蒸汽蒸馏法 适用于挥发性成分（主要是挥发油）的提取 （三）升华法 适用于某些具有升华性质的中药，如咖啡因、樟脑等提取。 （四）其它法 压榨法、微波提取法，半仿生提取法，酶法提取等。,二 中药有效成分的分离精制方法,分离精制常用 方法原理:,4.物质分子大小差异进行分离,3.物质的吸附性差别进行分离,2.物质在两相溶剂中的分配比不 同进行分离,

12、1.物质溶解度差别进行分离,常用分离精制方法,溶剂法：酸碱溶剂法；溶剂分配法,沉淀法：专属试剂沉淀法；分级沉 淀法；盐析法,结晶法,色谱分离法,膜分离法,升华法,分馏法,吸附色谱,凝胶过滤色谱,大孔吸附树脂色谱,离子交换色谱,分配色谱,（一）溶剂法 1.酸碱溶剂法 a 碱性成分+无机酸 盐 b 酸性成分+碱水 盐 c 内酯或内酰胺结构的成分 碱开环，酸闭环 d pH梯度萃取法,S水小,S水大,当提取物中含有难溶于水的酸、碱性成分时，该如何处理？,用于皂苷类,正丁醇,氯仿,乙酸乙酯,用于生物碱类,用于黄酮类,用于挥发油,石油醚、乙醚,萃取溶剂的选择,（一）两相溶剂萃取法 1.萃取法 原理 K=,

13、CA CB,四部位法,石油醚或正己烷,应用 系统溶剂法 操作方式？,氯仿或乙醚,乙酸乙酯,正丁醇,三部位法,石油醚或正己烷,氯仿或乙醚,正丁醇,极性,极性,1.专属试剂沉淀法,雷式铵盐+水溶性生物碱 沉淀,胆甾醇+甾体皂苷 沉淀,明胶 + 鞣质 沉淀,（二）沉淀法,2.分级沉淀法,（1）水提醇沉法（水/醇法） 除去多糖、蛋白质等水溶性 杂质,（2）醇提水沉法（醇/水法） 除去树脂、叶绿素等脂溶性杂质,（3）醇/醚（丙酮）法 皂苷的纯化（除去脂溶性杂质）,3.盐析法,混合物水液+无机盐 S成分 降低,一定浓度或饱和,常用的无机盐：氯化钠、 硫酸钠、硫酸镁等,（三）分馏法 利用混合物中各成分的沸点

14、不同而进行的分离。 常用的方法：常压分馏、减压分馏、分子蒸馏等。 （四）升华法 原理：固体物质的升华性质。 如小分子生物碱、香豆素等。,（五）膜分离法 1.原理 根据膜内外能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离。 2.种类（按孔径） 微滤膜（0.02514m） 超滤膜（0.0010.02 m ） 反渗透膜（ 0.00010.001 m ） 纳米膜（约2nm）,（3）应用 纯化大分子化合物时，除去无机盐或其他小分子杂质，如精制药用酶时必须除去无机盐。可用透析法脱盐。 生产中药注射剂和大输液，采用膜分离技术可以有效除去鞣质、蛋白质、淀粉、树脂等大分子物质及其微粒、亚微粒和絮凝

15、物等。 提取中药有效成分、口服液、药酒和其他制剂。,（六）结晶法 重点掌握13点内容 结晶法的关键：选择合适的溶剂 1、重结晶法中溶剂选择的一般原则 遵循“相似相溶”原则，满足“五个必须条件”。可以为单一溶剂；也可以为混合溶剂（对被结晶物质溶解度很大和很小的两种溶剂混合在一起，如乙醚-甲醇等）。 溶剂一般可比需要量多加20%左右。,1,2,3,1）对欲纯化的成分热时溶解，冷时析出； 2）对杂质冷热均易溶或均不溶,与欲结晶的成分不发生化学反应,沸点适中，安全、易得等,结晶溶剂的选择,常用溶剂：甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等,2、重结晶的操作要求 溶剂加热至沸点，被结晶物质溶解为热过饱和状态，

16、趁热过滤，滤液冷却结晶。不纯的结晶，可多次反复操作，得到较纯结晶（为重结晶）。 3、判断结晶纯度的方法 （1）结晶形态和色泽晶形均一；色泽一致。,（2）熔点和熔距 单一化合物重结晶前后的熔点应该一致；熔距在1C-2C的范围内。注意双熔点：汉防己乙素、芫花素及一些与糖结合的苷类化合物。,（3）色谱法（正反相色谱） 常用的方法：纸色谱、纸上电泳、薄层色谱。 另外还有的方法：HPLC、GC、MS、NMR等。 斑点要求：不拖尾的近乎圆形的斑点。 判断条件：三种以上不同展开剂，使Rf值分别0.2、0.5、0.8；各种呈色反应均为一个斑点。,薄层色谱图,乙腈试剂的HPLC图谱,乙腈溶解的23-乙酰泽泻醇B

17、标准品HPLC图谱,（七）色谱分离法,原理：利用混合物中各成分在固定相和流动相中亲和作用的差异（包括吸附能力，分配系数，分子量大小，解离度，亲和作用等）而达到分离的目的。 用途：分离（化学成分之间） 纯化（精制去杂） 鉴定（Rf值，保留时间）,1.吸附色谱法,（1）原理 利用吸附剂对混合物中各组分的吸附能力的差异而分离。,物理吸附,化学吸附,半化学吸附,在天然有机化合 物分离及精制工 作中，吸附现象 利用得十分广泛。 其中又以固-液 吸附用得最多， 分为：,A. 物理吸附吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭,吸附色谱的分离效果，决定于: 吸附剂(硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭）、 溶剂和被分离化合物的性

18、质这三个因素。,B. 半化学吸附吸附剂：聚酰胺,a、物理吸附 硅胶（最常用）、氧化铝、活性碳柱色谱,吸附剂 硅胶 氧化铝 活性炭,性质 中等极性的酸性 弱碱性吸附剂 非极性吸附剂 吸附剂 应用 分离范围广,大多 碱性、中性亲 水溶性物质 成分皆可,但不宜 脂性成分， 糖类，氨基酸 分离碱性成分 尤其适合生物碱,b、半化学吸附 聚酰胺柱色谱主要为氢键吸附,原理,应用 特别适合于酚类和醌类，比如黄酮类、蒽醌类及鞣质等成分分离,实验室中最常应用的混合溶剂,洗脱用溶剂 的极性宜逐 步增加，跳 跃不能太大。,洗脱溶剂的选择被分离物质与所选用的吸附剂性质,2.凝胶过滤色谱法,（1）原理 分子筛 洗脱规律：

19、 大分子先被洗脱出柱， 小分子后被洗脱。,（2）种类与性质 凝胶的代表是葡萄糖系列， Sephadex G-25,G-50，G-75,G-100等，洗脱溶剂主要是水。一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。 Sephadex LH-20 不但可在水中用，也可在有机溶剂中或在水与有机溶剂的混合溶剂中使用。 Sephadex LH-20保留了Sephadex G-25原有的分子筛特性；在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常起到反相分配色谱的效果。应用范围更广泛。,其他：丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等,3.大孔吸附树脂色谱法 白色球状的人工合成的有机高聚物。有极性和非极性两种； （1）吸附原理：吸附

20、（范德华引力或氢键吸附）和分子筛（大分子先被洗脱，小分子后被洗脱）。 被分离成分之间分子量相似：色谱行为表现为吸附 被分离成分之间极性相似：色谱行为表现为分子筛,（2）特性 a.理化性质稳定，不溶于水和有机溶剂，常温下对稀酸稀碱稳定； b.多孔网状结构，比表S大，吸附容量大； c.对有机物选择性较好，不受无机盐类的影响； d.使用后，可再生重复使用。,（3）应用 中药有效部位的富集，有效成分的分离纯化，尤其对皂苷、黄酮、生物碱等方面的纯化有独特优势。 如人参、三七、绞股蓝皂苷； 葛根、山楂、银杏、淫羊藿总黄酮； 红豆杉生物碱； 中药复方（生脉注射液、右归煎液）,黄芪 黄芪中黄芪甲苷的含量测定

21、（中国药典 2005版） 供试品溶液的制备 取本品中粉约4g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 小时，提取液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取4 次，每次40ml，合并正丁醇提取液，用氨试液充分洗涤2 次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过101 型大孔吸附树脂柱 (内径1.5cm,长12cm),以水50ml洗脱，弃去水液，再用40乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml 量瓶内，加甲醇至刻度，摇匀，即得。,应用实例,

22、4.离子交换色谱法 （1）原理： 混合物中各成分的解离度差异而得到分离 以离子交换树脂为固定相，以水或碱水或 酸水为流动相 （2）种类 阳离子交换树脂：强酸性（-SO3H+） 弱酸性（-COO-H+） 阴离子交换树脂：强碱性（季铵，-N+（CH3）3Cl-） 弱碱性（伯-NH2、仲=NH、叔胺N）,（3）用于相同电荷、不同电荷的分离 阳离子交换树脂用于分离不同碱性的生物碱。生物碱碱性强，易被阳离子交换树脂吸附，难被洗脱。相反，也然。如东莨菪碱、莨菪碱和小檗碱的分离。 B + HCl BH+Cl- R-SO3H+ + BH+Cl- R-SO3BH+ + H+Cl-,碱性增强,洗脱顺序如何？,阳离

23、子交换树脂对盐酸麻黄碱交换吸附与解离的研究 INTERACTION OF EXCHANGE AND DESORPTION BETWEEN EPHEDRINE HYDROCHLORIDE AND CATIONEX CHANGER 离子交换与吸附2001，17（04）:54-57. 作者: 赵东旭, 王云山, 查丽杭, 苏志国 摘要：研究了强酸型阳离子交换树脂对盐酸麻黄碱的交换吸附与解离作用.发现在弱碱和酸性溶液中树脂对盐酸麻黄碱的亲和力很强,强碱性环境则不利于同树脂的亲和;用2.0 Mol/L NaOH或2.0 Mol/L HCl作为解离液时的解离效果优于2.0 Mol/L NaCl溶液的解离液

24、效果;温度对解离的影响不是很大,在室温条件下进行解离即可取得较好的解离效果;选用了有机溶剂乙醇、乙二醇、乙腈和四氢呋喃作为解离增强剂,以乙醇较为合适,且其浓度在15%左右时较好;在给定离子交换柱中的解离情况,用含2.0 Mol/L HCl 的15%乙醇洗脱时,回收率为91%.,实例,5.分配色谱法 （1）原理： 被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离。 正相色谱：固定相极性大于流动相；分离极性大或水溶性的成分，如生物碱、苷、糖类、有机酸等。 反相色谱：固定相极性小于流动相；分离极性小和中的成分，如黄酮、蒽醌、皂苷、生物碱等。 反相固定相亲脂性：RP-18RP-8RP-2,化学修饰,

25、（2）加压柱色谱 快速色谱（2.02 105Pa） 低压色谱（LPLC， 5.05 105Pa ） 中压色谱（MPLC，5.05 105Pa 20.2 105Pa ） 高压色谱（HPLC， 20.2 105Pa ）,RP-HPLC分离制备银杏酚酸类单体成分 Separation and Preparation of Ginkgolic Acid 1 by RP-HPLC 中成药2002年 第24卷 第01期 作者: 倪澜荪, 林雁飞, 张鉴 目的:研究银杏酸1单体的制备技术.方法:以乙醇为提取溶剂获得的乙醇浸膏经硅胶吸附能除去大部分极性较大的杂质,RP-HPLC分离制备银杏酸1单体.结果:银杏

26、酸1的提取率达84%以上,纯度可达98%.结论:该方法简便易行,大大降低了工作量. 关键词: 银杏酸;制备;反相高效液相色谱法,应用实例,例题 1、下列物质可作为超临界流体的为（ B ） A、一氧化碳 B、二氧化碳 C、硫化氢 D、甲醇 E、乙醇 2、通常用于化合物有效成分提取的方法是（ADE） A、溶剂法 B、液-液萃取法 C、pH梯度萃取法 D、水蒸气蒸馏法 E、升华法 3、最适合于CO2超临界萃取的中药成分为（C） A、皂苷 B、多糖 C、挥发油 D、生物碱 E、蛋白质 4、从植物药材浓缩水提取液中除去多糖、蛋白质等水溶性杂质的方法为（A） A、水-醇法 B、醇-水法 C、醇-醚法 D、

27、醇-丙酮法 E、酸-碱法,5.判断结晶的纯度常根据（ABCDE） A、结晶的形态 B、结晶的色泽 C、结晶的熔点 D、结晶的熔距 E、结晶的TLC斑点单一 6.聚酰胺薄层色谱法特别适用于分离哪类化合物（ABD） A、酚类 B、黄酮类 C、皂苷类 D、醌类 E、萜类 7、A、酸碱法 B、水醇法 C、醇醚法 D、盐析法 （1）欲纯化总皂苷常采用方法是（C） （2）提取生物碱常采用方法是（A） （3）除去生药中多糖常用方法是（B） （4）在溶液中加入无机盐促使有效成分析出的方法是（D）,8、A、大孔树脂 B、凝胶过滤法 C、硅胶色谱法 D、液-液萃取法 E、聚酰胺 色谱法 （1）根据分子大小进行分离的方法是（B） （2）主要用于极性较大的物质的分离和富集的吸附剂是（ A） （3）用正丁醇将皂苷类成分从水溶液中分离出来的方法是（D） （4）分离黄酮苷元类成分最适宜的方法是（E） 9、大孔树脂的分离原理包括（ABD） A、氢键吸附 B、范德华引力 C、化学吸附 D、分子筛 E、分配系数差异 10、填料为RP-18、RP-8、RP-2的键合相硅胶色谱为（A） A、反相分配色谱 B、正