2015高通量测序专题培训：2015高通量测序培训课程-常见NGS方案实验流程及常见问题解析-讲义

1、常见NGS方案实验流程及问题解析,魏冬凯 2015.8.24,概要,常见NGS方案实验原理及流程介绍 常见问题解析 Hiseq测序仪相关知识及指标,概要,常见NGS方案实验原理及流程介绍 常见问题解析 Hiseq测序仪相关知识及指标,基因组学研究 基因组重测序 未知基因组测序 单细胞基因组测序,表观遗传学研究 全基因组甲基化测序 MeDIP-Seq 简化甲基化测序,免疫组学研究 ChIP-Seq,靶向区域研究 全外显子组测序 靶向捕获测序 扩增子测序,转录组学研究 mRNA-Seq 全转录组测序 单细胞转录组组测序,转录表达调控研究 sRNA-Seq,转录因子研究 RIP-Seq,DNA测序,

2、DNA文库,cDNA测序,NGS基本流程,STEP1,样本前处理,STEP2,文库构建,STEP3,上机测序,STEP4,生物信息分析,样本前处理,样本前处理都做些什么？ 核酸提取（DNA/RNA) 样本类型有哪些？ 人，动物的血液及器官组织等。 植物（根茎叶，胚芽，种子等）。 微生物（细菌，真菌）。,DNA提取,DNA提取的基本原理 DNA溶于水，在钠盐比在水中的溶解度较大。 但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。,DNA在生物体中的存在形式,DNA在细胞中常以核酸蛋白复合体（核蛋白）形式存在。,DNA提取基本流程,细胞破碎,杂质去除,沉淀DNA,溶解DNA,DNA提取总原则,保证核酸一级

3、结构的完整性； 排除其它分子的污染。,DNA提取方法概述,人，动物组织（SDS法） 人，动物全血，体液等（离心柱法） 植物组织提取（CTAB法） 质粒DNA（碱裂解法/离心柱法） 线粒体/叶绿体DNA（SDS差速离心法）,DNA提取方法概述,人，动物组织（SDS法） 人，动物全血，体液等（离心柱法） 植物组织提取（CTAB法） 质粒DNA（碱裂解法/离心柱法） 线粒体/叶绿体DNA（SDS差速离心法）,Lysis Buffer,样本 破碎,细胞 裂解,56,离心,取上清,25:24:1 酚氯仿异戊醇,Lysis Buffer,离心,取上清,24:1 氯仿 异戊醇,离心,取上清,乙醇 异丙醇,7

4、0% 乙醇,离心,离心,溶解DNA,Lysis Buffer（裂解缓冲液）,Tris-HCl (pH 8.0)：提供碱性反应条件，防止DNA酸解。 EDTA(pH 8.0)：大分子螯合二价阳离子，抑制DNase活性。 SDS：去垢剂，破坏细胞膜，解离核蛋白，使蛋白质变性。 Proteinase K：广谱蛋白酶，在SDS，EDTA存在下活性很高，高效催化蛋白质降解成多肽 或氨基酸，释放DNA。,样本破碎,尽量选取新鲜的组织样本，若是冷冻样本，避免反复冻融。 研磨的整个过程必须保持低温。 佩带棉手套后必须佩带一层PE手套，防止液氮冻伤！,细胞裂解,裂解需充分 材料适量，过多的材料会导致裂解不充分，

5、从而影响后续DNA得率低，质量差。 消化过程中，定时轻轻震荡。 温度55-60都可以。 必要时，可消化过夜。,去除蛋白质,酚:氯仿:异戊醇（25:24:1 V/V）溶液 酚：（被水或Tris-HCl 8.0饱和的酚）强烈的蛋白质变性剂，在初步纯化时，可有效的使蛋白质变性从而去除。 异戊醇：消泡剂，帮助有机分相。,去除其他有机杂质,氯仿：异戊醇（24:1 V/V） 氯仿： 1. 高效蛋白质变性剂，具有高效溶脂性，可以有效去除脂类。 2. 本步骤中的氯仿可以萃取微量溶解在水相中的酚。 异戊醇：消泡剂，帮助有机分相。,DNA沉淀,完整的基因组DNA（gDNA）片段大，可以直接使用2-3倍体积乙醇或0

6、.6-1倍体积异丙醇常温加入并颠倒数次，即可看见成团白色沉淀。 降解或片段偏小的DNA，可用预冷的乙醇或异丙醇进行沉淀，必要时可放置-20沉淀过夜。,盐离子去除,70%乙醇 DNA不溶于乙醇，盐离子溶解于水。,DNA干燥,本步骤必须进行！ 乙醇残留会抑制PCR反应，酶反应等等。 干燥时间一般控制在2-5分钟。 不能过度干燥，否则沉淀很难溶解！,DNA溶解,长期保存DNA，建议用TE溶解，EDTA可抑制DNase活性。 若需要立刻进行建库反应，可用水或Tris-HCl （pH 8.0）溶解。 如果过度干燥导致沉淀溶解困难，可放置4轻度震荡过夜溶解。,DNA质检,质检内容：浓度、纯度、完整性 质检

7、所用方法： Qubit 2.0（荧光定量双链DNA技术） Nanodrop 分光光度技术（OD） DNA水平凝胶电泳,浓度质检,NanoDrop也可以测浓度，为什么一定要用Qubit？ NanoDrop基于核酸紫外吸收原理，若有单链DNA，RNA或部分蛋白，脂类也会影响紫外吸收，导致定量偏高。 Qubit使用的荧光染料可以特异结合双链DNA，提高定量准确性。 DNA纯度越高，NanoDrop定量结果与Qubit定量结果的差异就越小。 Qubit与PicoGreen有什么区别？ 都使用荧光染料定量双链DNA，从使用原理上没有根本性区别。 PicoGreen可实现自动化，使用酶标仪进行定量。 两者

8、的定量范围相同，但Picogreen在使用低浓度标准曲线的状态下，对极微量的样本定量较为准确。,纯度质检,NanoDrop OD260/OD280：核酸与蛋白的吸收比值 OD260/OD230：核酸与糖的吸收比值,完整度检测,琼脂糖水平凝胶电泳,RNA污染,DNA质检标准,浓度 c 100ng/ul 总量 m 2ug OD260/OD280： 1.8-2.0 OD260/OD230 2.0,电泳图,文库构建,为什么要构建文库？ 基因组必须要经过均一化处理之后，才能被测序仪识别。 文库可以告知测序仪从哪个碱基开始识别。 必须通过文库进行信号放大。,文库构建的总原则,不能有其他外来物种污染。 不能

9、有接头二聚体。 保证基因组覆盖完整度。 扩增偏好尽量低。 单个项目必须保证统一试剂，统一操作！,基础文库构建流程,DNA纯化,目的：纯化目的核酸片段，清除影响后续实验的分子污染，保证核酸纯度。,纯化方法： 1、传统的酚/氯仿抽提 优点：适用性强 ，尤其可以纯化大片段。 缺点：酚、氯仿都是对人体有害的物质；耗时长；对操作要求高 2、借助某些介质 吸附柱离心法：纯度达到80%以上；方便、快捷。 磁珠：磁珠表面包被、修饰，捕获特定的DNA片段，分离不用离心，容易集成到生 物芯片上，实现样品处理自动化和微型化。 3、凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳胶回收、PAGE凝胶电泳等。 在电泳后需要切胶回收，应用方法一

10、或方法二。,DNA纯化,目的：纯化目的核酸片段，清除影响后续实验的分子污染，保证核酸纯度。,纯化方法： 1、传统的酚/氯仿抽提 优点：适用性强 ，尤其可以纯化大片段。 缺点：酚、氯仿都是对人体有害的物质；耗时长；对操作要求高 2、借助某些介质 ：纯度达到80%以上；方便、快捷。 磁珠：磁珠表面包被、修饰，捕获特定的DNA片段，分离不用离心，容易集成到生 物芯片上，实现样品处理自动化和微型化。 3、凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳胶回收、PAGE凝胶电泳等。 在电泳后需要切胶回收，应用方法一或方法二。,吸附柱离心法,吸附柱离心法,原理,吸附膜主要成分硅胶、纤维，又称硅胶膜、硅胶柱。 硅胶是一种多孔性物质

11、，分子中具有硅氧烷的交链结构，而硅氧烷分子含有硅醇基，其含量与其核酸的结合能力有关。 在高盐、低PH值条件下，硅胶表面上的硅醇基释放出氢离子，通过高盐溶液中的阳离子与DNA的磷酸基团结合，DNA被吸附在硅胶膜上；相反在低盐、高PH值的条件下就会释放出DNA。,纯化三原则： 不能混淆样本 不能污染样本、试剂 省时、省物,不要忘记加乙醇！,纯化步骤,片段化DNA,实验准备,结合,洗涤,空转,环吸及晾干,洗脱,10min,50min,实验准备,清理桌面 准备试剂及耗材 离心管准备及标注： 取吸附柱和离心管需用镊子 。 标注原则：名称要与待纯化样本完全相同，并且纯化后需标注“已纯化”类似字样，以便区分

12、。 标注要求：管盖及管壁均标注，且写在磨砂处。,样本结合,操作方法： 加入5倍体积结合液PB混匀，转入吸附柱中，静置1min 操作要求： 分别转移样品或者悬空滴加PB 尽量一个样本使用1个枪头 多次转移时，注意样本间交叉污染,切记静置1min！,过柱及弃废液,8000rpm，30sec,倒废液：倒前准备吸水纸；切勿伸入废液瓶；沾液时不同样品管切勿使用同一位置。,离心力不可过大！,洗涤,操作方法： 加入740ml PW溶液 8000rpm，30sec 倒废液（要求同前）,操作要求： 悬空滴加 尽量只使用1个枪头,枪头一旦触碰样本，立刻弃掉，严禁污染试剂！,空转、环吸及晾干,操作方法： 12000

13、rpm，空转3min 环吸后晾干3min 操作要求： 1. 环吸方法： 用小枪头对准管壁的余液，旋转枪头吸干余液。 2. 不可过度晾干！,洗脱,操作方法： 加入 EB（Elution Buffer） 静置5min（55孵育可提高回收率） 12000rpm，2min 操作要求： EB加在膜中央，加入后，环、壁上均无液体 在弃管前做最后核对，以免串样,为什么要进行末端修复？ 随机打断后的DNA一般都会产生不规则的末端，无法直接进行测序接头连接，因此需要进行末端修复。 为什么要加dATP？ 为了提高连接效率，所以在测序接头的3端加1个dTTP，与Insert的dATP互补。,基因组DNA,打断,平端

14、,5端突出,3端突出,5端突出,3端突出,基因组DNA,打断,平端,5端突出,3端突出,5端突出,3端突出,T4 DNA 聚合酶,T4 DNA 聚合酶,已补平DNA,DNA磷酸化激酶,P,P,A,A,Taq聚合酶,磷酸化的目的 填补连接缺口，提高连接效率,本步骤温控程序 25 30min 72 20min,P,P,Illumina 接头,Rd1 Seq Primer,P5,Rd2 Seq Primer,Index,P7,Y型接头的目的减少接头自连的可能性！,T,P,T4 DNA连接酶,T,P,P,T,连接温控条件 22 1hr,连接反应需注意： 反应时间不可过长。 测序接头要足量。,连接反应后

15、必须纯化的理由 去除接头二聚体（128bp） 筛选合适的片段大小,纯化方法可选 电泳+切胶筛选+胶回收 2.磁珠纯化并筛选大小,电泳,2% 琼脂糖凝胶，100V 1.5h,同时选择多个片段大小,胶回收（Qiagen 离心柱法）,电泳的优点,1.成本低。 2.可同时筛选多个大小。 3.筛选范围可控，灵敏。,电泳的缺点,1.不可自动化。 2.小分子在分子迁移过程中易残留。 3.DNA紫外灯下暴露易发生损伤。 4.操作时间长。,磁珠 Ampure XP Beads(Beckman Coulter）,磁珠两步结合法筛选DNA片段大小,磁珠的优点,1. 可自动化，可重复性高。 2. 操作时间短。 3.

16、回收率高。 4. 可以高效去除小片段。,磁珠的缺点,1.成本高。 2.筛选范围偏宽，不适合片段要求窄的文库构建。 3.很难同时筛选多个大小。,PCR扩增,P5,P5,P7,P7,95,PCR扩增,P5,P5,P7,P7,95,P5,P5,P7,P7,65,P5 primer,P7 primer,P5,P5,P7,P7,55,P5 primer,P7 primer,72,P5,P5,P7,P7,55,P5 primer,P7 primer,72,必须严格控制PCR循环数！ 过度PCR只会带来差的测序数据！,如果文库浓度不够，是不是可以多做几个PCR循环？,文库质检,一个好的文库应该符合哪些标准？

17、 完全没有接头二聚体和引物二聚体。 峰型呈正态分布，并在期望范围内。 浓度满足上机需要即可，没有特别要求。 不可出现过度PCR的大片段。,文库质检,常见文库2100质检图,质量差的文库,引物二聚体,接头二聚体,文库,过度PCR,只占比50%！,基因组学研究,全基因组重测序（WGRS） 未知基因组测序（De Novo） 单细胞基因组测序（Single Cell）,基因组学研究,全基因组重测序（WGRS） 未知基因组测序（De Novo） 单细胞基因组测序（Single Cell）,研究对象： 有参考基因组的物种。 研究方法： 建库：最基本的DNA文库构建方法。 测序方案：个体测序一般30X，种群

18、测序一般6X,基因组学研究,全基因组重测序（WGRS） 未知基因组测序（De Novo） 单细胞基因组测序（Single Cell）,研究对象： 无参考基因组的物种，物种的种群最好不要过大。 研究方法： 建库：基本DNA文库，长片段（Mate-Pair)文库，必要时需要构建Fosmid或BAC文库。 测序方案：按照文库长度递增。,De Novo大致流程,基因组学研究,全基因组重测序（WGRS） 未知基因组测序（De Novo） 单细胞基因组测序（Single Cell）,研究对象： 主要是人的1个或者几个细胞或者极少量DNA 研究方法： 建库：单细胞扩增（MALBAC）+基本DNA文库测序方案

19、：全基因组测序30X,为何选择MALBAC？,检验方法： 采用9对持家基因对扩增产物进行qPCR MALBAC与MDA各做3个生物学重复,靶向区域研究,全外显子组测序 靶向捕获测序 扩增子测序,靶向区域研究,全外显子组测序 （Whole Exome Sequencing） 靶向捕获测序 扩增子测序,研究对象： 主要是人，Roche芯片现有一些特殊物种。 研究方法： 建库：基本DNA文库+外显子杂交芯片捕获 测序方案：100X,杂交平台,探针携带生物素标记。 捕获富集的片段用亲和链霉素磁珠进行筛选。 Roche V3.0 64Mb Agilent V5 54Mb,外显子基本研究策略,Nature

20、 Genetics， 2009,靶向区域研究,全外显子组测序 靶向捕获测序（Target Sequencing） 扩增子测序,研究对象： 主要是人，捕获用的探针是根据自身需要订制的。 研究方法： 建库：基本DNA文库+订制探针杂交芯片捕获 测序方案：200X以上,比外显子测序所需数据量更少，大幅提高测序深度，降低测序成本！,靶向区域研究,全外显子组测序 靶向捕获测序 扩增子测序（Amplicon）,研究对象： 主要是人，使用扩增特异性引物扩增目的片段。 研究方法： 建库：扩增目的区域+DNA建库 测序方案：200X以上,通量较小，适合几个基因或较少位点的研究。 PCR容易引入人为错配，增加分析

21、噪音。,表观遗传学研究,全基因组甲基化测序（BS-Seq） MeDIP-Seq 简化甲基化测序（RRBS）,表观遗传学研究,全基因组甲基化测序（BS-Seq） MeDIP-Seq 简化甲基化测序（RRBS）,研究对象： 主要是人，人源细胞等。 研究方法： 建库：DNA建库+重亚硫酸盐处理 测序方案：30X以上,表观遗传学研究,全基因组甲基化测序（BS-Seq） MeDIP-Seq 简化甲基化测序（RRBS）,研究对象： 主要是人，人源细胞等。 研究方法： 建库：DNA建库+5mC抗体包被磁珠处理 测序方案：50X以上,表观遗传学研究,全基因组甲基化测序（BS-Seq） MeDIP-Seq 简化

22、甲基化测序（RRBS）,研究对象： 主要是人，小鼠，大鼠。 研究方法： 建库：MspI酶切+DNA建库+重亚硫酸盐处理 测序方案：50X以上,免疫组学研究,ChIP-Seq（染色质免疫共沉淀测序）,研究对象： 主要是人，人源细胞等。 研究方法： 建库：染色质免疫共沉淀+DNA建库 测序方案：50X以上,转录组学研究,mRNA-Seq 全转录组测序 单细胞转录组组测序,转录组学研究,mRNA-Seq 全转录组测序 单细胞转录组组测序,研究对象： 所有真核生物，没有特别限制的物种。 研究方法： 建库：mRNA富集+反转录+DNA建库 测序方案：100X以上,转录组学研究,mRNA-Seq 全转录组

23、测序 （去除rRNA，包括原核生物）,研究对象： 原核生物，人源微生物，人，小鼠，大鼠，植物。 研究方法： 建库：去除rRNA+反转录+DNA建库 测序方案：100X以上,转录组测序,RiboMinus/Ribo-zero LifeTech /Epicentre,Ribo-Zero OR RiboMinus?,WO 2011/019993 PCT/US2010/045437,全转录组测序,转录组学研究,mRNA-Seq 全转录组测序 单细胞转录组组测序,研究对象： 主要是人，人源细胞。 研究方法： 建库：SMART技术+DNA建库 测序方案：100X以上,转录表达调控研究,sRNA-Seq,研

24、究对象： 主要为人，小鼠，大鼠。 研究方法： 建库：小RNA建库技术 测序方案：100X以上,转录因子研究,RIP-Seq（RNA免疫共沉淀测序）,研究对象： 主要为人源细胞。 研究方法： 建库：RIP+RNA反转录+DNA建库 测序方案：100X以上,Have A Break!,概要,常见NGS方案实验原理及流程介绍 常见问题解析 Hiseq测序仪相关知识及指标,DNA提取中的常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 2. DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 3. DNA中残留有金属离子,解决方案,1.重新纯化D

25、NA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 3.增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取中的常见问题,问题二：DNA降解。,原因,1.材料不新鲜或反复冻融 2.未很好抑制内源核酸酶的活性 3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 4.外源核酸酶污染,解决方案,1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 3.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 4.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,问题三：DNA量太少,DNA提取中的常见问题,原因,1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时DNA

26、丢失,解决方案,1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 2.动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 3. 裂解时，时间延长，可过夜 4.低温沉淀，延长沉淀时间 5.加辅助物，促进沉淀 6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,DNA提取遇到的问题，大多数都来自于裂解不完全！,文库构建的常见问题,DNA片段化问题,DNA量过大 DNA质量差 溶解buffer粘稠度过高 Covaris使用不当,原因,解决,每次打断不超过10ug 严格执行DNA质检标准 使用水或TE溶解DNA 循环水位应在8以上 循环水温度应在4-8 开启机器后，需排气30min以上,问题一：打断DNA之后纯化产

27、物浓度过低,文库构建的常见问题,原因,DNA初始定量出错 使用Nanodrop进行DNA初始定量。 纯化步骤中操作错误。,解决方案,1.使用Qubit定量样本前，同一项目样本必须重做标准品。 2.浓度过高的样本，需要稀释后定量。 3.检查Qubit标准品的检测值是否在正常范围。 4.初始DNA定量必须使用荧光定量方法(Qubit/Picogreen/qPCR) 5.PW液在使用前没有加乙醇。 6.洗涤液和结合液混淆。,问题二：连接测序接头后纯化无产物,文库构建的常见问题,原因,磁珠使用不当。 切胶纯化时，操作失误。,解决方案,1.磁珠使用前必须放置在室温下预热半小时以上。 2.80%乙醇必须新

28、鲜配置。 3.磁珠洗脱液一定要使用EB或者RSB，不可用水。 4.胶块没有完全溶解。 5.PW液没有加乙醇就使用。 6.PW和PB混淆。 7.磁珠干燥时间过长。,问题三：构建出的文库有接头二聚体。,文库构建的常见问题,原因,连接反应时间过长。 连接反应用的接头量过大。 连接反应时DNA量已经很少。 跑胶进行片段筛选前没有用磁珠纯化。 磁珠纯化比例错误。,解决方案,1.连接反应时间必须严格控制。 2.连接反应必须终止，可以采用热终止或EDTA。 3.接头量必须严格控制，如果DNA量过少，必须减少接头用量。 4.跑胶前必须先用磁珠1:1进行纯化。 5. 磁珠纯化比例为DNA：磁珠=1:1或者可以适

29、当减少磁珠用量，切勿增大！,文库构建的常见问题,打断的DNA,300bp,文库,740bp,问题四：连接产生了嵌合体(cross mapping),根本原因：连接导致！ 连接温度过高。 连接反应时间过长。 接头过少。 某些AT极端偏好的物种。,解决方法： 严格控制连接反应时间和温度。 定期检查接头浓度，接头一定要足量。 打断DNA后增加筛选大小步骤。 采取一些有针对性的建库手段。,问题四：文库后不正常的大片段？,文库构建的常见问题,原因： 连接反应时间过长。 PCR循环过多！ 磁珠筛选时操作不当。,解决方法： 严格控制连接反应时间和温度。 PCR循环一定要严格遵守操作规则。 磁力架磁力不足，磁

30、珠容易掉落。 反应产物过多，磁珠偏少。,一些较差的文库示例,操作不当是导致文库构建失败最根本的原因！,概要,常见NGS方案实验原理及流程介绍 常见问题解析 Hiseq测序仪相关知识及指标,Solexa测序原理,准备DNA片段,两端接上 adapters,将DNA片段通过adapter锚定在芯片上,循环扩增DNA片段成“DNA簇”,Cluster形成,可逆终止反应Reversible Terminator Chemistry,4种标记过的核苷酸,测序,Sequencing-by-Synthesis (SBS),掺入一个碱基,Cycle 1: 加入反应体系,移除其他未掺入的核苷酸,信号检测,Cycle 2-n: 加入反应体系，循环cycle 1,1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的保护基团