《血清学实验技术》PPT课件.ppt

1、第二十四章 血清学试验,第一节 血清学反应概论,概念：在体外进行的抗原抗体反应，一般采用血清进行，称为血清学反应,Ag,血清(Ab),Ag-Ab复合物,pH 7.0 370C,一、血清学反应的一般规律 二、血清抗体的制备原则 三、影响血清学反应的因素 四、血清学反应的应用,一、血清学反应的一般规律,（一）抗原与抗体结合的胶体形状变化,抗体在溶液中以胶体状态存在,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,范德华力 抗原抗体互补空间关系有助于该力发挥作用。 静电引力 氨基与羧基 氢键结合力 大于范德华力 疏水作用 抗原抗体分子上非极性氨

2、基酸，提供的作用力最大,(二)抗原抗体作用的结合力,比例适合才出现最强的反应。沉淀反应 抗原抗体反应的等价带: 最适比时，抗原抗体结合充分，沉淀物形成快而多，上清中存在少量游离。 带现象：如抗原或抗体过剩，其结合价不能相互饱和，则抗原与抗体仅能形成小分子的复合物，不出现肉眼可见的反应。,（三）抗原抗体的结合比例,前带,后带,非共价键结合，一定条件下可解离 结合强度取决于特异性抗体Fab片段与抗原决定簇立体构型的吻合程度 稀释和冻融可使复合物解离 解离与否：1、亲和力；2、环境因素 （pH、离子强度）,（四）抗原与抗体结合的可逆性,利用抗原抗体特异性结合反应的可逆性规律，建立亲和层析技术，纯化免

3、疫纯的抗原或抗体。,第一阶段：特异性结合；时间短，数秒到数分钟 第二阶段：可见反应阶段，表现为凝集、沉淀等可见反应；时间长，数分钟到数日,（五）抗原抗体反应的阶段性,二、血清抗体的制备原则,1.免疫动物的选择 选择动物时应考虑以下因素： 抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。,2.抗原及佐剂 (1) 免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱

4、、动物的个体状态、免疫时间、所要求的抗体特性来确定。 首次免疫时，剂量不宜过大或过小，以免产生免疫耐受或不能形成足够刺激。 高特异性低剂量短程免疫；高效价大剂量长程免疫 (2)免疫佐剂: 某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。,佐剂的种类 佐剂一般包括以下几类： 无机佐剂： 如氢氧化铝、明钒等 生物性佐剂： 如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等； 人工合成佐剂： 如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C

5、）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； 油剂： 如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等； 纳米佐剂,弗氏佐剂（Freunds adjuvant）,分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊毛脂或吐温-80）按1：11：5比例混合而成； 后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混匀，制成“油包水”乳化液。,佐剂与抗原混合乳化的方法： 研磨法 搅拌混合法,佐剂的免疫生物学作用 增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的物质变成持久或强的免疫原； 增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应答和再次应答所产生的抗体滴度； 改变抗体类型，使产生抗

6、体由IgM型转变为IgG型； 引起或增强迟发性超敏反应。,佐剂的作用机制 佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种： 可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性。 佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的滞留时间，有利于抗原的缓慢释放。 增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。,3. 免疫途径与免疫间隔时间 免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗

7、体产生的重要因素，其中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以1020天为佳，二次后间隔时间一般为710天，若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。,4. 免疫血清的保存,1、4保存（6个月） 2、低温保存（-70 -20 ，5年） 3、真空干燥保存（5 10年） 注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）,三、影响血清学反应的因素,抗体的来源：不同动物的免疫血清反应性存在差异。家兔，等价带宽，抗原过量才出现可溶性免疫复合物 抗体的浓度：相对抗原而言 抗体的特异性和亲和力： 早期抗体特异性较好，亲和力低 晚期亲和力高类型复杂，反应性复杂 单抗的特异性好但亲和力低，不适用于

8、低灵敏度的沉淀反应或凝集反应。,（1）抗体因素,三、影响血清学反应的因素,理化性状：可溶性（沉淀反应）、颗粒性（凝集反应） 抗原决定簇数目：单价与多价：单价抗原与抗体结合不出现可见反应,（2）抗原因素,（3）电解质亲水变疏水，降低抗原抗体的电势，利于二者结合 （4）pH值pH6.09.0均可以，常用 pH7.07.2。 抗原抗体蛋白的等电点在 pH6以下，若抗原或抗体溶液pH接近等电点，自身就会凝聚，出现非特异性的凝集或沉淀反应。设立阳性、阴性和空白对照。 （5）温度：15400C均可，温度低反应慢，温度高反应快。最常用370C 30min。 （6）时间反应速度：亲和力、类型、介质、温度等，液

9、相中抗原抗体很快达到平衡，但在琼脂中就慢。 （7）杂质异物反应中如存在有与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等，往往会抑制反应进行，或引起非特异性反应。,四、血清学反应的应用,抗原抗体的定性检测： 检测抗体 检测抗原 抗原或抗体的定量检测： 免疫复合物产量推算样品中的抗原/抗体量：ELISA 效价滴定：把浓度低的反应成分（抗原或抗体）固定，另一成分做梯度稀释。 免疫标记技术：流式、 抗原的定位 免疫组化,第二节 血清学反应类型,凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 补体结合反应 中和试验 免疫电镜 免疫沉淀 免疫转印,一、凝集反应,概念：细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合，在有电解质存在下，形成肉

10、眼可见的凝集团块，称为凝集反应。,凝集原 凝集素,（一）直接凝集试验,1.玻片凝集反应 将含有已知抗体的诊断血清 (适当稀释)与待检菌悬液各一滴在玻片上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法简便快速，适用于新分得细菌的鉴定或分型。如沙门氏菌的鉴定、血型的鉴定等多采用此法，为一种定性试验。 也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存在相应抗体，如布氏杆菌的玻板凝集反应和鸡白痢全血平板凝集试验。,概念：将颗粒性抗原直接与相应的抗体反应出现肉眼可见的凝集块的现象,2.试管凝集试验,试管法为一种定量试验，用已知抗原以检测待测血清中是否存在相应抗体和测定该抗体的含量，以协助临床诊

11、断或供流行病学调查。,（二）间接凝集试验,正向间接凝集试验（检测抗体）、反向间接凝集试验（检测抗原）间接凝集抑制试验、协同凝集试验,抗球蛋白实验 机体受某些抗原刺激后，可产生不完全抗体，由于这种抗体体积较小、长度短，只能与颗粒抗原一方相结合(又称单价抗体)，因而不能出现肉眼可见的凝集反应。抗原表位被不完全抗体封闭（封闭抗体）。不完全抗体免疫异种动物可获得抗球蛋白抗体（抗抗体），抗抗体与抗原颗粒上吸附的不完全抗体结合，产生凝集反应。,（三）Coombs实验,直接Coombs试验:用于检测已粘附在红细胞表面的不完全抗体。,间接Coombs试验 :用于检测游离在血清中的不完全抗体,二、沉淀反应,概念

12、：可溶性抗原与相应抗体结合，在有电解质存在下，形成肉眼可见的沉淀现象。细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、血清、组织浸出液等。,2、种类（1）液相沉淀试验：絮状沉淀试验、环状沉淀试验、免疫浊度测定（2）凝胶沉淀试验：免疫扩散试验（单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩/琼扩）、免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳,对流免疫电泳,Ag为阳性；Ag为弱阳性；Ag为强阳性；Ag为强阳性,三、免疫标记技术,抗原与抗体结合了，但复合物小，不能通过凝集或沉淀用肉眼观察到。 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体

13、。,检测标记物的存在，间接反映抗原抗体发生了结合。 抗原抗体反应的特异性 标记分子的敏感性 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP,免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验(Enzyme-L

14、inked ImmunoSorbent Assay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体,酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),3.

15、原理（以间接性ELISA为例）：,显色,四、补体结合反应,补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。,补反中包括两个系统五种成分： 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag 补体:仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,待测系统 抗原+未知血清,补体,1,2,Step 1 抗原抗体复合物的形成,Step 2 补体的结合和耗竭,指示系统 SRBC+抗SRBC抗体,Step 3 SRBC的裂解,1,2,1：No Ab； 2：Ab,Ag,Y,Ab 阳性,No Ab 阴性,Ag,Ag,Ag

16、,五、中和试验,病毒或毒素与相应的抗体结合，抗体中和了病毒或毒素，失去了对易感动物的致病力，这种试验称为中和试验。,Western Blot （参考）,Diagram,通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测。 蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白,原理,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳缓冲液：PH8.3Tris-甘氨酸-SDS系统。,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,灌制分离胶 隔绝空气,灌好后一般室温放置3040分钟,SDS-聚丙

17、烯酰胺凝胶电泳,灌制积层胶 插入梳子,上样及电泳,提前将样品沸水浴5分钟，13000rpm离心10分钟。 根据自己的设计上样。 80V恒压跑浓缩胶。 看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为100V。 当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.6mm时停止电泳。,转膜,蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。,膜的封闭,为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理,一般用5的脱脂奶粉或者3的BSA室温或37度封闭2小时。,转好蛋白的膜,Protein,Protein,封闭,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,一抗孵育,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,Primary Antibody,二抗孵育,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,E,E,Primary Antibody,Secondary Antibody,显影,Protein,Protein,Blocking Agent,Bloc