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文档简介

1、,限制酶切方式及连接,1 限制酶切的方式,1.1 单酶切 1.2 双酶切 1.3 部分酶切 1.4 完全酶切,1限制酶切的方式,1.1 单酶切 若DNA样品是环状DNA分子，产生与识别序列（n）相同的DNA片段数。 若DNA样品是LDNA片段，完全酶切产生n+1个DNA片段。,1限制酶切的方式,1.1 单酶切 酶切体系： 13L ddH2O 反应体系 2L 10buffer 4L 底物DNA 1L 限制酶 总体积：20L,酶切步骤： 加样； 摇匀，短时离心； 反应13h； 反应终止。 65水浴1015min,1限制酶切的方式,1.2 双酶切 用不同的限制酶切割同一DNA分子的方法。 环状DNA

2、分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数之和。 线性DNA分子完全酶切的结果，产生DNA片段数是两种限制酶识别序列数加1.,双酶切可以在不同的反应系统中进行。 A 需要较低盐浓度的酶先切割，然后升高盐浓度，另一个酶切割； B 最适反应温度较低的酶先切割，然后升高温度，另一个酶切割； C 第一个酶切割后，经凝胶电泳回收DNA，再选用合适反应系统，进行第二个酶的切割。,D 双酶切在同一个反应系统中。,1 限制酶切的方式,1.3 部分酶切 指限制酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。 用途：当某种限制酶的多个识别序列之中有一个识别序列恰好在回收待用的DNA片段上，若完

3、全酶切，将此DNA片段从中切断。 为了解决这个问题，就需要用到部分酶切，以满足实验的需要。,2 限制酶切后的连接,2.1 DNA ligase: 能催化dsDNA片段紧靠在一起的3羟基末端与5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。,2.2 DNA片段之间的连接 具互补黏性末端之间的连接 具平末端之间的连接,具互补黏性末端片段之间的连接,5GGACTG-0H P-AATTCTGCAA-3 3CCTGACTTAA-P 0H-GACGTT-5 E.coR I 切割 E.coR I切割 DNA ligase 5GGACTGAATTCTGCAA-3 3CCTGACTTAAGACGTT

4、-5 E.coR I 识别序列,结论： 待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一个酶切割的，连接后仍保留原限制酶的识别序列。,Bam H切割反应,T4 DNA ligase,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,具平末端DNA片段之间的连接,5CAAGCTCA3 5GTAGCTTA3 3GTTCGAGT5 3CATCGAAT5 AluI AluI P-CTCA-3 5CAAG-OH P-CTTA3 5GTAG-OH OH-GAGT5 3GTTC-P OH-GAAT-5 3CATC-P T4 DNA ligase 5CA AGCT TA-3 3GT TCGA AT-5 AluI AGCT Hind AAGCTT,结论： 如果两个DNA片段的末端是用同一种酶切割后产生的，

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