微生物的生长与环境条件

1、第六章 微生物的生长和环境条件,第一节、微生物群体的生长,一、获的纯培养的方法,1、纯培养的定义：从一个细胞繁殖所得到的后代细胞群体称为纯培养。,2、获得纯培养的方法：,（1）稀释-液体培养法,（2）单细胞挑取法,（3）平板培养分离法,（3）平板培养分离法 ： A、平板划线分离法 B、涂布平板法 C、倾注（混合）平板法,划线分离法步骤：,划线,挑菌,灼烧,划线,灼烧,划线,二、细菌群体数量的测量,1、显微直接计数法,优点：快速、方便 缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数；（甲醛或适度加热 （不能把计数板加热） 需要相对高的细菌浓度；（107cell/ml） 个体小的细菌在显微镜

2、下难以观察；,2、比浊法,在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.) 表示菌量。波长一般选定在450650nm,培养基颜色,颗粒杂质,3、稀释平板法,（1）倾注平板法 (混合平板法),（2）涂布平板法,菌落计数,混合平板和涂布平板的区别,一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示原样品中的细胞数。,4、膜过滤培养法,当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样 品通过膜过滤器，然后将将膜转到相应的培养基上进行培养，对形 成的菌落进行统计。,主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进

3、行直接鉴定并计数的微生物。,5、MPN法：most probable number,对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。,三、分批生长中细菌群体的生长,(一)生长曲线,生长曲线(Growth Curve)：,细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量， 以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细 菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。,细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图,一条典型的生长曲线至少可以分为 延滞期，对数期，稳

4、定期和衰亡期 四个生长时期,延滞期(Lag phase)：,将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。,延滞期的特点：,分裂迟缓、代谢活跃,细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍 。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。 对外界不良条件反应敏感。,迟缓期出现的原因：,微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶， 或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢 产物，就需要一段适应期。,在生

5、产实践中缩短迟缓期的常用手段：,(1)利用对数生长期的细胞作为种子；,(2)尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；,(3)适当扩大接种量,对数生长期(Log phase)：,又称指数生长期(Exponential phase)以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。,对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定。,在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时(Generation time)，在群体生长里细菌数量增加一倍所需 的时间称为倍增时间（Doubling time)。代时通常以

6、G表示。,稳定生长期(Stationary phase)：,由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜 于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等 于细菌死亡数)。,稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数 最高并维持稳定。,生长得率:每摩尔底物产生的菌体干重,衰亡期(Decline或Death phase)：,营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生 速率，整个群体呈现出负增长。,同步培养(Synchronous culture)：,使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶 段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养

7、方法。,(二) 同步培养,同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传 特性，它是一种理想的材料。,密度梯度离心法获得同步细胞的基本步骤,分部收集 各层细胞,细胞分层,离心后,不同步 群体细菌,10% 蔗糖 30% 梯度,利用各部细胞接种,硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法,由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代， 随后又逐渐转变为随机生长。,连续培养(Continous culture ）,在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定 的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。,四、细菌群体生长的连续培养,（一）恒浊连续培养,测定所培养微生物

8、的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低； 当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；,恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的,（二）恒化连续培养,使培养液流速保持不变，并使微生物在恒定的 生长速率下进行生长繁殖。,连续培养的简化流程图,稀释率：每小时流加的新鲜培养液占总培养液体积的百分比,第二节、微生物个体生长和分化,第三节、环境条件对微生物生长和代谢的影响,1、温度,低温型微生物：专性低温微生物和兼性低温微生物 中温型微生物：分布最广 高温型微生物：嗜热微生物和极端

9、嗜热微生物,一、控制微生物的物理因素,最低温度 最适温度 最高温度,低温型微生物,中温型微生物,高温型微生物,(1)干热灭菌,高温使蛋白质、核酸等重要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上的类脂成分，导致微生物死亡。,高温杀菌,(2)湿热灭菌,湿热比干热灭菌更好：,水蒸汽的气化热高，更易于传递热量；,湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：,多数细菌和真菌的营养细胞：在60左右处理5-10分钟； 酵母菌和真菌的孢子：用80以上温度处理； 细菌的芽孢：121处理10分钟以上；,各种细菌的芽孢在湿热中的 致死温度和致死时间,空气排除程度与温度的关系,（3）其它湿热灭菌方式,1）巴斯德消毒（paste

10、urization）,60-85处理15秒至30分钟,2）煮沸消毒,3）间歇灭菌（fractional sterilization OR tyndallization）,4）瞬间加压灭菌（continuous autoclaving ）,135-150，5-15秒，工业上发酵培养基 135-150，2-6秒，牛奶或其它液态食品,（超高温灭菌）,UTH超高温灭菌乳是在本世纪60年代出现的一种产品，首先是由英国的巴顿等研究者提出。其原理是根据牛奶在加热中细菌的灭菌效果（SE），也就是杀孢子效率随着温度的上升，大大快于牛乳中的化学变化（褐变、维生素破坏、蛋白质变性等）。在温度有效范围内，热处理温度每

11、升高10，牛乳中所含细菌孢子的破坏速度性提高11-30倍，而牛乳中化学变化褐变速度仅提高2.5-3倍，Q10=2.5-3。这意味着温度越高，其灭菌效果越大，而引起的化学变化很小。,低温保藏菌种，实践中，采用低温保藏食品，防止杂菌生长,斜面: 4石蜡油: 4 沙土管: 4 甘油管: -70,液氮冻干管: 4 水: 常温,2、 辐射作用,辐射灭菌(Radiation Sterilization)是利用电磁辐射产生的电磁波 杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。,用于灭菌的电磁波有紫外线(UV)、X-射线和-射线等,电磁波灭菌的机理：,UV引起DNA的断裂、DNA分子双链的交联以及嘧啶二聚体的形成

12、等，其中形成胸腺嘧啶二聚体是最主要的作用。胸腺嘧啶二聚体会阻碍双链的解链与复制、碱基的正常配对，引起突变。 生成臭氧,胸腺嘧啶二聚体,电离辐射诱变剂:x射线、射线、快中子、射线、射线和超声波等，在微生物诱变育种中以前面四种用得比较多。,直接作用:辐射的量子击中染色体，导致发生直接的原始损伤。 间接作用:辐射作用使得细胞中的分子尤其是大量的水分子产生电离，进而形成各种自由基，这些自由基团再进一步与细胞内活性大分子产生一系列生物化学反应，造成染色体损伤，导致突变。,可见光（400-760nm）：,紫外线（200-400nm）：,电离辐射：,杀菌效果不明显,杀菌效果明显，但穿透能力不强，只能用于表面

13、灭菌。,波长短，能量高，穿透能力强，杀菌效果很明显,3、氧气,氧气对微生物的毒害机制： 产生活性氧（超氧负离子、过氧化氢、羟基自由基）,据微生物对氧气的敏感性： 好氧微生物、厌氧微生物,O2 + e - O2- 2O2- + 2H + H2O2 + O2 O2-+H2O2 O2 + OH - + OH,好氧菌消除活性氧伤害的机制： 产生SOD、过氧化氢酶和过氧化物酶消除活性氧,2O2-+ 2H+ H2O2,2H2O2 O2 + 2H2O,2H2O2 + NADH+H+ NAD + + 2H2O,超氧化物歧化酶,接触酶,过氧化物酶,二、控制微生物的化学因素：各种有机或无机杀菌剂或抑菌剂,机理：蛋

14、白质变性,代表：苯酚（石炭酸）,（1）酚：,1、有机化合物,应用范围：地面，家具，皮肤等,石炭酸系数： 指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度 和达到同效的石炭酸的最高稀释度的比率。一般规定处理时间为 10分钟，而供试菌定为Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）。,（2）醇,机理：蛋白质变性、细胞脱水,代表：乙醇（75%）,应用范围：器械、皮肤,（3）醛,机理：蛋白质变性,代表：福尔马林液（40%甲醛）,应用范围：熏蒸、标本保藏,（4）酸,机理：蛋白质变性,代表：醋酸、苯甲酸、山梨酸,应用范围：房间消毒、防腐剂,（5）表面活性剂,机理：破坏细胞膜,代表：新洁尔灭、洗衣粉、

15、洗涤剂等,应用范围：器械、皮肤,2、无机化合物:卤化物、重金属、氧化剂等,（1）卤化物：碘、和氯,机理：破坏细胞膜,代表：碘酒、漂白粉、氯气,应用范围：碘酒-皮肤 氯气-自来水、游泳池、澡堂 漂白粉-地面,机理：与蛋白质中的巯基结合,代表：升汞、硫酸铜,应用范围：非金属器皿表面消毒、真菌病害,（2）重金属,（3）生石灰：地面、水井,机理：氧化蛋白质中活性基团,代表：高锰酸钾、臭氧、过氧化氢,应用范围：皮肤、物品表面等,（4）氧化剂,3、染料,机理：和蛋白质上羧基及核酸上磷酸基结合,代表：结晶紫、孔雀绿等,应用范围：皮肤创伤,4、抗代谢药和抗生素,有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相似，以至可以 和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行 ，这些物质称为抗代谢物(Antimetabolite)。,叶酸对抗物（磺胺）、 嘌呤对抗物（6-巯基嘌呤）、 苯丙氨酸对抗物（对氟苯丙氨酸）、 尿嘧啶对抗物（5-氟尿嘧啶）、 胸腺嘧啶