免疫学检测课件

1、教师：齐静姣 Department of Immunology,免疫学检测技术及其应用,学习要求 1.掌握抗原抗体反应的特点；凝集反应、 沉淀反应及免疫标记技术的原理和应用。 2.熟悉淋巴细胞的分离、T细胞及B细胞功 能测定的方法。,免疫学检测乃借助现代免疫学、细胞生物学和分子生物学理论或技术，对抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子等进行定性或定量检测。 可用于：免疫相关疾病的诊断 病情检测 疗效评价,一、Ag-Ab反应的特点： 特异性(specificity) 可逆性(reversibility) 比例性(proportionality) 阶段性,第一节 抗原或抗体的体外检测,适宜的Ag、

2、Ab浓度和比例,特异性(specificity)：是指一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合，即抗原抗体结合反应的专一性。 比例性(proportionality)：是指抗原与抗体特异性结合反应时, 生成肉眼可见结合物的量与反应物浓度的关系, 只有当二者浓度比例适当时,才出现可见反应。 可逆性(reversibility)：抗原与相应抗体结合成复合物后 , 在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体的特性。,二、抗原抗体反应的影响因素,抗原与抗体本身的因素 电解质：生理盐水、缓冲液 温度：最适37 酸碱度：一般为pH68,环境因素,凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 免疫PCR等,三、常用抗原-抗

3、体检测技术,（一）凝集反应（agglutination reaction） 指颗粒性抗原或覆盖可溶性抗原的颗粒性载体与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集现象。 凝集原（agglutinogen）：反应中的抗原 凝集素（agglutinin）：抗体,凝集反应分类： 直接凝集反应 间接凝集反应,1.直接凝集反应：颗粒性AgAb凝集物,常用的方法： 玻片法：定性实验：测Ag。 用于菌种分型、ABO血型鉴定。 试管法：半定量实验，测Ab。 如诊断伤寒病的肥达反应。,2.间接凝集反应,可溶性抗原（或抗体）,+,载体,+,相应的抗 体或抗原,致敏,致敏颗粒,肉眼可见的凝块,常用的载体颗粒：人O

4、型红细胞、绵羊红细胞、聚苯乙烯 乳胶颗粒、活性炭、SPA菌体等。,正向间接凝集试验检测抗体 Ab可溶性Ag凝集物,3.间接凝集抑制反应Ab可溶性AgIC 致敏载体不凝集,诊断试剂为抗原致敏的载体颗粒及相应的抗体， 用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。,阳性结果,阴性结果,（二）沉淀反应（precipitation ）： 可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物现象。 可溶性Ag：如血清蛋白、外毒素、细胞裂解液 或组织浸液、细菌滤液等。 类型：凝胶沉淀反应 （自由、定向、联合免疫扩散） 免疫比浊法 液相沉淀反应,1. 单向免疫扩散 ： 原理：将一定量已知抗体混

5、于琼脂凝 胶中制成琼脂板，使待测的Ag 溶液从局部向琼脂内自由扩散， 在一定区域内形成可见的沉淀物。 观察沉淀环，定量检测Ag。,单向免疫扩散,2. 双向免疫扩散： 原理：是将抗原与抗体分别加入琼脂 凝胶的对应小孔中，二者自由 向四周扩散并相遇，在比例合 适处形成白色的沉淀线。 观察沉淀线，定性检测Ag 或Ab。,3. 免疫电泳(immunoeletrophoresis,IEP) 为琼脂区带电泳和凝胶双扩散相结合的一种免疫技术。 原理:将待检血清标本先进行琼脂凝胶电泳，使血清中各蛋白组分被分成若干区带，然后按电泳方向平行挖一小槽，加入相应抗血清，与已分成区带的各抗原成分在琼脂中作双向免疫扩散，

6、在各区带相应位置形成沉淀弧。 临床上常用于骨髓瘤、-球蛋白缺乏症、肝脏疾病、白血病、系统性红斑狼疮等患者血清蛋白成分的分析。,（三）免疫标记技术 指用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原-抗体反应的检测技术。 是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。 具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位检测等优点。,1.酶免疫检测技术,用酶作标记物进行的抗原-抗体反应。 是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化底物的高效性相结合的免疫检测技术。 定量检测酶标测定仪 定性检测可肉眼判定,常用的酶： 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 常用的底物： HRP的底物：过氧化物（H2O2）

7、供氢体（四甲基联苯胺等） AP的底物: 对-硝基苯磷酸酯 常用的方法： 酶联免疫吸附试验 酶免疫组化技术,酶联免疫吸附试验（ELISA） 是将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，而后再行酶 催化底物的化学反应 。 用于测定可溶性抗原或抗体。 ELISA优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可 自动化监测。,（1）双抗体夹心法检测抗原,（2）间接法检测抗体,2.荧光免疫技术： 用荧光素标记抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察散发的荧光，可借此对抗原进行定性或定位检测。,荧光素： 异硫氰酸荧光素：呈明亮的黄绿色荧光 四乙基罗丹明：呈橘红色荧光 四甲基异硫氰酸

8、罗丹明：呈橙红色荧光 藻红蛋白：呈红色荧光,荧光免疫技术分为： 荧光免疫显微技术：用于固相标本检测； 主要有直接法、间接法。 荧光免疫测定技术：用于液体标本的检测； 主要有时间分辨荧光免疫测定、 荧光酶免疫测定。,（1）直接荧光法 待测抗原+荧光抗体 荧光效应 优点:特异性高. 缺点:检查任一抗原均须制备相应荧光抗体.,（2）间接荧光法 待测抗原+ 一抗+荧光二抗 荧光效应 优点:敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的 二抗可用于多种抗原的检测.,3.放射免疫测定技术,特点：1.用放射性核素标记抗原（或抗体） 2.既有放射性核素的高灵敏度，又 有抗原抗体反应的特异性。 3.用同位素检测仪检测

9、4.检测灵敏度可达pg水平 5.存在放射性污染的弊端,常用标记物：,型放射性核素： 125I、 131I、 51Cr 、 60Co，以125I最常用。 型放射性核素： 3H 、14C、 32P，以3H最常用。,检测免疫细胞的数量与功能，是判断机体免疫功能状态的重要指标。 免疫细胞主要来源： 人体外周血 实验动物胸腺、脾脏、淋巴结等。,第二节 免疫细胞及其功能检测,一、外周血单个核细胞的分离,( peripheral blood mononuclear cell， PBMC ) 常用方法： 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 体外检测淋巴细胞，首先需分离PBMC。,外周血单个核细胞的分离,分离液,抗

10、凝血,离心,淋巴细胞,二、淋巴细胞及其亚群的分离 E花环分离法 尼龙棉柱分离法 免疫吸附分离法 磁珠分离法 流式细胞术,检测T、B淋巴细胞的功能有助于某些疾病的辅助诊断、疗效观察及科研分析。,三、免疫细胞功能测定,（一） T细胞功能测定 1. T细胞增殖试验 形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法 2.T细胞分泌细胞因子功能测定 3.特异性抗原皮肤试验,（1）形态学检查法,分离PBMC 与适量PHA混合 37，培养72h. 取培养细胞涂片染色 镜检细胞 正常人的T细胞转化率为6080,（2）3H-TdR掺入法 在T细胞增殖过程中，胞内DNA合成增加，应用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Td

11、R）可掺入细胞新合成的DNA中，所掺入放射性核素的量与细胞增殖水平呈正比。 测定样品放射活性液体闪烁仪。 该法灵敏可靠，易发生放射性污染。,淋巴细胞增殖实验,（3）MTT比色法 MTT是一种噻唑盐，其掺入细胞后可作为胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物，形成褐色甲臢颗粒并沉积于胞内或细胞周围，甲臢生成量与细胞增殖水平呈正相关。甲臢可被盐酸异丙醇或二甲基亚砜完全溶解，借助酶标测定仪检测细胞培养物OD值，可反映细胞增殖水平。该法灵敏度不及3H-TdR掺入法，但操作简便，且无放射性污染。,（二）B细胞功能测定,B细胞增殖试验 酶联免疫斑点法（ELISPOT） 溶血空斑试验,ELISPOT示意图,溶血空斑试验 原理： 抗体形成细胞分泌的Ig与SRBC表面抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数。,溶血空斑实验 测定抗体形成细胞,（三） 细胞毒活性测定 检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。 主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面研究。,常用检测方法,51Cr释放法 乳酸脱氢酶（LDH）释放法 细胞染色法 凋亡细胞检测法,51Cr释放法： 用Na251CrO4 标记靶