2-3 细菌遗传学_PPT课件

1、引言：遗传学的发展,一、神创论与进化论 19世纪之前：神创论，圣经，亚里士多德(事物大链条)-英国博物学家伯纳特；林奈系统分类和物种-布封，古生物化石的地层分布(与诺亚大洪水解释之矛盾) 、居维叶(古生物学与比较解剖学) 1859年之后：达尔文物种起源，“物竞天择，适者生存”进化论思想；拉马克、华莱士。 (寻找生命的逻辑 方舟子),二、 孟德尔遗传规律的发现 1866年，孟德尔根据他的豌豆杂交实验结果，发表了论文植物杂交试验，揭示了现在称为孟德尔定律的遗传规律，奠定了遗传学的基础。 孟德尔的工作于1900年为德弗里斯、德国植物遗传学家科伦斯和奥地利植物遗传学家切尔马克三位学者分别发现。1900

2、1910年，除证实了植物中的豌豆、玉米等和动物中的鸡、小鼠、豚鼠等的某些性状的遗传符合孟德尔定律以外，还确立了遗传学的一些基本概念；1909年丹麦植物生理学家和遗传学家约翰森称孟德尔式遗传中的遗传因子为基因，并且明确区别基因型和表型。 孟德尔的发出直到20世纪初受到重视其间，关于细胞分裂、染色体行为和受精过程等方面的研究和对于遗传物质的认识，促进了遗传学的发展。,从18751884的几年中，德国解剖学和细胞学家弗莱明在动物中，德国植物学和细胞学家施特拉斯布格在植物中分别发现了有丝分裂、减数分裂、染色体的纵向分裂，以及分裂后的趋向两极的行为；比利时动物学家贝内登还观察到马副蛔虫的每一个身体细胞中

3、含有等数的染色体；德国动物学家赫特维希在动物中，施特拉斯布格在植物中分别发现受精现象。这些发现都为遗传的染色体学说奠定了基础。 关于遗传的物质基础历来有所臆测。例如1864年英国哲学家斯宾塞称之为活粒；1868年英国生物学家达尔文称之为微芽；1884年瑞士植物学家内格利称之为异胞质；1889年荷兰学者德弗里斯称之为泛生子；1883年德国动物学家魏斯曼称之为种质。实际上魏斯曼所说的种质已经不再是单纯的臆测了，他已经指明生殖细胞的染色体便是种质，并且明确地区分种质和体质，认为种质可以影响体质，而体质不能影响种质，在理论上为遗传学的发展开辟了道路。,三、从1910年到现在，遗传学的发展大致可以分为三

4、个时期：细胞遗传学时期、微生物遗传学时期和分子遗传学时期。 细胞遗传学时期大致是19101940年，可从美国遗传和发育生物学家摩尔根在1910年发表关于果蝇的性连锁遗传开始，到1941年，美国遗传学家比德尔和美国生物化学家塔特姆发表关于链孢霉的营养缺陷型方面的研究结果为止。 这一时期通过对遗传学规律和染色体行为的研究确立了遗传的染色体学说。这一时期中虽然由美国遗传学家马勒和斯塔德勒分别在动植物中发现了 X射线的诱变作用，可是对于基因突变机制的研究并没有进展。基因作用机制研究的重要成果则几乎只限于动植物色素的遗传研究方面。,微生物遗传学时期大致是19401960年，从1941年比德尔和塔特姆发表

5、关于脉孢霉属中的研究结果开始，到19601961年法国分子遗传学家雅各布和莫诺发表关于大肠杆菌的操纵子学说为止。 在这一时期中，采用微生物作为材料研究基因的原初作用、精细结构、化学本质、突变机制以及细菌的基因重组、基因调控等，取得了已往在高等动植物研究中难以取得的成果，从而丰富了遗传学的基础理论。19001910年人们只认识到孟德尔定律广泛适用于高等动植物，微生物遗传学时期的工作成就，则使人们认识到遗传学的基本规律适用于包括人和噬菌体在内的一切生物。 分子遗传学时期从1953年美国分子生物学家沃森和英国分子生物学家克里克提出DNA的双螺，旋模型开始，但是50年代只在DNA分子结构和复制方面取得

6、了一些成就，而遗传密码、mRNA、tRNA、核糖体的功能等则几乎都是60年代才得以初步阐明。,补充培养基：在基本培养基中有针对性地加上某一种或几种其自身不能合成的成分，以满足相应营养缺陷型生长的培养基。 营养缺陷型表示：所要求的营养物的头三个字母表示，如bio-，对应的野生型以bio+表示 营养缺陷型菌(auxotroph):不能在基本培养基上生长，而只能在营养培养基生长的菌株。该类型菌多是与生化合成反应有关的基因发生了变异，使正常的代谢过程受到阻碍。,细菌的基因符号和命名,例 Strain No. Sex genotype phenotype 菌株编号 性别 基因型 表型 CSH1 F-tr

7、pB-lacZ-thi-strA Trp-Lac-B1-Strr CSH13 FlacZ proA+ B+ ;(lac pro)supE thi F-：表示菌株丧失了性因子，F：性因子携带部分染色体基因。 基因座位用斜体的小写三个字母表示，产生同样表型的不同基因座位用斜体大写字母表示。如：色氨酸操纵子基因组由ABCDE五个基因组成，trpB-表示该操纵子的基因座位B发生了突变,变异(variation) 基因重组(Recombination) 染色体间 减数分裂中染色体的自由组合 染色体内 染色体的重排(Rearrangements) 转基因体外重组 突变(Mutation) 基因突变 染色体

8、畸变（Aberration）,突变的自发性,从孟德尔遗传学到分子现代遗传学的建立都是以变异的研究为基础的。无论是基因结构的确定、基因定位，还是基因表达和调控，以及育种等实际应用都是如此。细菌的遗传学则主要以其中的变异体为实验材料进行研究。 突变是指遗传物质突然发生了稳定的可遗传的变化.包括数量与结构的改变。,突变的自发性,以细菌进行遗传学试验之困惑：如细菌的抗药必性：是细菌接触到药物后才产生抗药性呢(诱导产生)，还是没有接触到药物之前就产生了呢(自发产生)。如果不用药就无法知道细菌有无抗药性，而用药之后，以难以区分细菌的突变是自发的还是被诱导的。 三个经典实验：波动、涂布、影印培养法,波动试验

9、Fluctuation test,1943年S.E. Luria Genetics 28:491-511) T1 phage: 烈性噬菌体。当用T1感染E.coli敏感菌时， E.coli将被裂解，涂布平板后将没有菌落。当E.coli发生突变后产生对T1的抗性，则会出现菌落,噬菌体(bacteriaphage or phage)是感染细菌的一类病毒，结构很简单，基本上由一个蛋白质外壳包裹着一些核酸组成的。噬菌体的多样性来自于组成其外壳的蛋白质的种类，以及其染色体的类型和结构的不同。 烈性噬菌体 、温和噬菌体,Phage-picture,实验推理：如果细菌的抗性是由phage引起的(adapta

10、tion),则分装于小管中的样品将出现大致相等数目的抗性细菌，但如果抗性突变是自发的，则各小管中样品中所含突变的细菌数应与发生突变的早晚有关。 实验结果：各小管所涂平板抗性菌落数相差极大，说明抗性不是phage诱导出来的，而是在接触到phage之前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。,Luria & Delbruck,涂布试验,涂布试验于1949年 由H. Newcombe 设计。其原理与波动试验相同。所使用的材料也是T1 phage和E.coli (BG：p42),二、涂布试验,Newcombe涂布实验结果,结果解释：如果细菌抗性是诱发的，加入phage前重新涂布无非使细菌所处的位置发

11、生了变化，但如果是自发产生的，则可使重新涂布的培养皿中长出多得多的抗性菌落。,三、影印培养法,1951年J&E Lederberg 发明影印培养法法(Replica plating) 直接证明了突变的自发性：细菌的抗药性发生在加入药物以前，而药物的作用只是把突变型筛选出来。(BG:p44) 影印培养法可以分离出纯种的突变株，它在微生物遗传的理论和育种研究中都有广泛的应用,Like the fluctuation test, replica plating shows that mutations are not induced by the selective media on the pla

12、te.The X on the plates is to indicate that they have the same orientation,基因突变的类型,1、按遗传物质的改变：点突变、多点突变；碱基置换(substituion)、碱基插入(insertion)、碱基缺失(deletion)和移码(frame shift) 2、按表型：形态突变，生化突变(营养缺陷型、糖发酵能力、抗性突变型、对药物的依赖)，致死性突变(条件致死性：Ts), 毒力改变以及抗原性突变 3.按突变所引起的遗传信息意义是否改变：错义 (missense)、同义(samesence)和无义(nonsense)突变

13、,基因突变的类型,1、营养缺陷型： 1941-1944年Beadle & Tatum 认为如果特定代谢途径中的酶是受基因控制的话，则其中某一基因的突变就不再产生相应的酶，就应得到相应的突变株。提出 “one gene-one enzyme hypothesis (BG：p46) 营养培养基、基本培养基、E.coli 1%的菌落。补充成份的基本培养基。 Leu- Ade- 实验说明：细菌从野生型到营养缺陷型的突变是基因突变，该基因负责编码那种营养成份的生物合成中的酶,基因突变的类型,2、糖发酵突变型：EMB琼脂、MacConkey琼脂。(P48) 应用这些培养基，分离得到了一系列用糖和醇作为碳源

14、和能源的E.coli突变型。如：半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl) 、甘露糖(Mtl)、麦芽糖(Mal)等。对这些突变型进行酶学分析，发现它们大部分是缺乏某种酶。通过对这些突变型的研究对了解糖酵解的代谢途径和机制作出了重要贡献。,基因突变的类型,3、温度敏感突变型(P49)：1951年 Horowitz, E.coli,基本培养基，40 、48h转至25、120h。161个Ts ，其中37个是营养缺陷型，其余的是当时不清楚。 这些Ts不是生理适应问题，本质是某一基因发生突变从而使某种菌体蛋白(或 酶)一级结构发生结构的改变。这样的蛋白质只能在许可的温度下才能维持其空间结构，具

15、有正常的生理功能，当达到限制温度时，该蛋白质的就要变性失去功能。,回复突变,以前所述基因突变均为所编码蛋白质功能的丧失或功能的变化属于正向突变(forward mutation). 但自然界也大量存在突变型重新获得野生表型的回复过程，称为回复突变(reverse or back mutation)。如：His- His+ 回复突变一个重要的应用是作为诱变剂和致癌剂的检测手段。通过检测某一化学物质或物理因素诱发细菌回复突变的能力，来推测其致癌效应，方法有多种，但以1975年B.Ames建立的方法应用最广(P72) Ames试验： His-鼠伤寒沙门菌(rfa uvrB his- ),突变的分子基

16、础(自学),诱变剂的作用 自发突变的机制 错配修复与增变基因(mutator gene):dam mutH mutL mutS uvrD 突变的热点,突变类型的筛选,基因突变是通过其表型效应而被发现的，通常突变在群体中占极少数，因此需要用一些特别的方法来区分突变型与野生型菌。前述的影印培养法、EMB指示平板法。 筛选过程：野生型菌 诱变剂处理 突变型浓缩突变型分离 突变型鉴定,1、青霉素浓缩法：,2、 差别杀菌法：,3、饥饿法 (p78),青霉素只杀死正在生长的细菌，而营养缺陷型菌在基本培养基上不能生长，所以不会被青霉素杀死。用该法可筛选多重营养缺陷型菌。,用加热处理来浓缩可形成芽孢的细菌的营

17、养陷型菌。将孢子置于基本培养基上生长，然后加热，野生型菌因芽孢萌发而被杀死，但突变型菌不能生长，仍处于孢子状态而存活下来。,某些营养缺陷型菌株在一些培养条件下会死亡，但当细胞中发生另一营养缺陷突变时，反而使细菌能存活下来。如：E.coli Thy-菌在无Thy的基本培养基中培养可得到另外一些营养缺陷型菌株,突变类型的筛选：突变型的浓缩,突变类型的筛选：突变型的分离,1、逐个分离法：基本培养基、营养琼脂培养基 2、夹层培养法：经浓缩的营养缺陷型菌先在基本培养上生长, 待原养型菌生长成菌落后，再在培养皿上倒一层营养培养基，新长出的菌落即是营养缺陷型菌 3、限量补给法：基本培养基加0.1%的LB琼脂

18、平板，然后涂布经浓缩的营养缺陷型菌。在此平板上，原养菌生长快而形成较大的菌落，而营养缺陷型菌生长慢而形成极小的菌落,突变类型的筛选,突变型的鉴定：有正选择(抗性突变)和负选择两种(营养缺陷型) 1、生长谱法：(P80) 2、梯度培养皿法:用于检测抗药性突变,梯度培养皿法,底层：不含抗生素 上层：含抗生素,细菌生长情况,基因转移,除基因发生突变外，还有细菌间的基因转移也可使细菌的遗传物质和表型发生变化 在细菌中遗传物质有三种转移的形式: 转化（transformation）：细胞从周围介质中吸收裸露 的DNA （在动物细胞中，从周围介质中吸收任何裸露DNA都称为转染。在酵母和植物细胞中导入裸露的

19、DNA可以称为转染或转化) 接合（conjugation）： DNA从细胞到细胞直接转移, 需要细菌与细菌之间的直接接触； 转导（transduction）：对裸露的病毒基因组DNA/RNA的吸收，需要噬菌体用为媒介。,基因转移的共同特点： （1）单方向转移； (2) 产生部分二倍体（partial diploid）； （3）基因只有整合到环状染色体上才能稳定地遗传，多数情况下以附加体形式存在也能稳定遗传，但有时附加体可能发生丢失。,基因转移 转化(一),转化（transformation）：DNA从细胞到细胞直接转移，是指来自一个细菌的少数遗传信息的DNA转移到另一个细菌中，前者为供体菌，后

20、者为受体菌，表现为受体菌的遗传标记和生物表型发生改变。发生了这种菌改变的细菌被称为转化子。分工程转化和自然转化两种。,Griffiths Experiments in Bacterial Transformation,自然转化（natural transformation） 在自然转化中细菌可以自由地吸收 DNA，通过它来进行遗传转化；肺炎球菌、嗜血杆菌、枯草杆菌等的转化属于自然转化。,质 粒,细 菌,工程转化（engineered transformation） E.coli在自然条件下，不能通过转化的方式获得外源基因，但在对数生长期用CaCl2处理，可使E.coli获得这种能力，在这种转化

21、中细菌发生改变使得它 们能摄入并转化外源DNA。E.coli 转化就属于工程转化。,transformation 1.概念： （1）转化：受体细胞从外界直接吸收了来自供体细胞 DNA片断，并与其染色体同源片段进行遗传物质变换， 从而使受体细胞获得了新的遗传特性的现象。 细菌由于摄入外源DNA片断而获得新的遗传标记 （2）转化子：经转化后出现了供体性状的受体细胞，即是转化成功的菌落。 （3）转化因子：有转化活性的外来DNA片段(Avery,1944)。 （4）感受态： 细菌能够从周围环境中吸收DNA分子 ，并使之不被DNA酶降解时的生理状态。一般出现于对数生长期的后期。但大肠杆菌不能自然形成感受

22、态。,2.转化条件： （1）受体菌：处于感受态 （2）外源DNA(转化因子)：具有高的相对分子质量和同源性(自然转化)。 3.转化过程 （1）感受态细胞的建立 （2）DNA的结合和摄取 （3）转化因子与染色体重组,细菌的接合-基因转移二,一、E.coli 接合的发现 1946年莱德伯格(Lederberg, J.) 和塔特姆 (Tatum) 发现细菌的接合（conjugation）。 细菌接合是指通过细胞的直接接触，遗传信息从供体单向转移到受体的过程。,Lederberg,研究细菌杂交的两大难题： abab ab (10-7 ） 和回复突变频率相近，难以区别。 (2) E.coli杂交产生重组

23、频率为107， 筛查重组子的工作量太大。 解决的方法： (1)使用多重突变型（multiple auxotrophs） (2)采用基本培养基和选择培养基,A品系：met bio thi leu thr（thi：硫胺素B1） B品系：met bio thi leu thr A A+B B 基本培 养基 met bio thi leu thr,conjugation,混合培养菌的平板上约每107个亲本细胞中出现一个原养型菌落 质疑： 是否为回复突变：任意2个基因突变的回复突变率均小于10-12 细菌的杂交实验获得的重组子可能是转化的结果。 (3)培养基中含有某些代谢产物，混合后这些产物互相补充了对

24、方的不足而得以在基本培养基上生长。,conjugation,两个亲本菌的作用是否等同 Hayes的发现：氯霉素处理A菌再与B菌杂交，结果没有影响，但用氯霉素处理B菌后再与A菌杂交，结果却没有重组子 细菌接合中的遗传物质的转移是单向过程，其中A作为遗传物质的供体，而重组发生在作为受体菌的B中,电镜下观察到的细菌接受现象,conjugation,供体或雄性菌(male) 受体或雌性菌(female) 决定雄性的是染色体外的一个共价环状的DNA分子，称为F性因子(F sex factor)或称至育因子(fertility factor)。雄性菌用F+表示，雌性菌用F-表示。F因子的主要表现是细胞表面

25、的性伞毛，是细胞接合所必须的。,接合,E.coli染色体基因图,高频重组菌(Hfr): 用诱变剂处理A菌可得到许多突变体，它们再与B菌杂交时，所产生重组体的频率比A菌B菌高出一千倍。 Hfr菌的F因子整合到宿主的染色体中可介导宿主DNA的转移 中断杂交法绘图(基因连锁图),接合,接合,基因转移三：转 导,利用噬菌体为媒介，将供体菌的部分DNA转移到受体菌的现象。 由于绝大多数细菌均有phage，且被转导的DNA是位于phage的蛋白质外壳内受到保护不会被DNA酶所降解，因而，转导作用比转化和接合作用更为普遍,transduction,transduction,transduction,tran

26、sduction,附：真核生物的基因脂移,Gene Transfer /delivery system 1.病毒载体：以腺病毒、反转录病毒载体最为成熟 2.非病毒载体：脂质体、磷酸钙、纳米颗粒、肽载体 3. 基因枪、显微注射,细菌中可转座的遗传因子,原核与真核细胞基因组中一些可以从一个位置转移到另一个位置的序列叫转座因子or易位因子(transpossable genetics elements)。细菌中有三类： 插入顺序(IS)： insertion sequences 转座子(Tn): Transposon 某些温和型phage:如Mu Jumping genes,A transposab

27、le element is a bit of DNA that can move from place to place in an organisms genome. It is excised from one site and inserted at another site The movement of a transposable element can generate mutations or chromosomal rearrangements and thus affect the expression of other genes.”,Transposable genetic elements: hypothetically predicted already in the 1940s and 1950s by Barbara McClintock(Cold Spring Harbour Labs, NY, USA),Nobel Prize 1983,在DNA重组技术建立之前，半乳糖操纵子研究基因突变的良好系统。因gal基因位于噬菌体整合位点产旁边从诱导产生的gal 转导噬菌体中很容易获得gal基因。在研究一些gal