第二章微生物的纯培养和显微技术

1、第二章微生物的纯培养及显微技术,1 微生物的纯培养,一、无菌技术,一、无菌技术 分离把自然界中以混杂状态生长在一起的各类微生物单个分开。 筛选根据菌种的形态特征和生理特征的不同结合生产实际的要求，灵活地、有的放矢地设计出各种优选方法以便快速而准确地挑选出所需要的菌种。 1、微生物培养的常用器具及其灭菌：试管、三角瓶、培养皿等。 2、接种操作,二、用固体培养基分离纯培养,菌落：在固体培养基上形成的子细胞群体。 纯培养：由一个细胞繁殖而成的群体，又称克隆。 菌苔：指菌体在固体培养基表面密集生长时，多个菌落融合在一起联成一片称菌苔。,分离方法,1、平板划线分离法 2、三角玻璃刮棒连续涂布法 3、稀释

2、分离法 常见的有十倍稀释法：每稀释一次菌细胞的浓度下降十倍。 4、稀释摇管法。,1、平板划线分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.,连续划线,划线分离后平板上显示的菌落照片,三角玻璃刮棒连续涂布图,稀释分离法,Organisms are serially diluted, then a small amount is added to an empty st

3、erile petri dish, to which melted agar at 50 C is added. Then mix to distribute the organisms.,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,9ml,9ml,9ml,9ml,十倍稀释图,经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物.,三、用液体培养基分离纯培养液体稀释法,四、显微单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微

4、镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,五、选择性培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 以纤维素或淀粉作唯一碳源可获分解菌。 富集培养 滤纸条培养基；石蜡油培养基,厌氧微生物分离方法,物理方法 A抽气法将培养物置真空干燥器中抽真空，再培养。 B充气法把培养物放一密闭贮器中充入N2（排

5、尽空气）,化学方法 A化学吸氧法利用化学反应耗氧达到形成厌氧环境的目的。 用焦性没食子酸（1g）与NaOH（10%）反应除氧（100ml空气中的O2）。 密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌氧环境 NaHSO3+NaCO3混和反应耗氧 B培养基预还原法 培养基中加入还原剂（半胱氨酸、Na2S Vc）再隔绝空气培养，适于培养专性厌氧菌。 生物方法 与需氧微生物共同培养,六、二元培养物 纯培养物：只有一种微生物的培养物。 混合培养物：含有两种以上微生物的培养物。 二元培养物：只含两种微生物且有意识地保持二者之间特定关系的培养物。,（一）菌种的衰退与复壮的概念 1.衰退（degeneration）

6、 ：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 衰退的原因：基因突变，分离现象。 常见的衰退现象： 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；,七、 菌种的衰退、复壮及保藏,2、 菌种的复壮（rejuvenation）：使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常

7、、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种菌种的复壮措施：纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。 通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。采用有效的菌种保藏方法。,3、防止菌种衰退的方法： 控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）； 选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞

8、进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）； 采用有效的菌种保藏方法。,（二）菌种保藏：1.原理：挑选优良菌种，人工创造低温、干燥、缺氧的环境条件，使微生物菌种的代谢活动处于最不活跃的休眠状态以达保持纯种的目的。2.目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种,不杂、不乱、 不衰、不退,3、方法：斜面低温保藏法原理：低温方法：将菌种接种在新鲜斜面培养基上适温培养至生长完全4冰箱保藏每隔一段时间移接一次说明：适于生产和科研中经常采用的菌种； 保藏时间： 霉 4个月 酵46个月 放 3个月 细 12个月 培养基应少含或不含糖分（尤以细菌） 试管密封以

9、隔绝空气优：方法简单，成活率高缺：保存时间短，传代次数多，易变异。,石蜡油封藏法 原理：低温、缺氧 方法：将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管内（油量高出斜面1cm）包扎后竖直放入冰箱保藏。 说明：液体石蜡于170干热灭菌1h。 斜面培养基能干燥则保藏效果好。 保藏时间12年。 适于保藏霉菌、酵母、放线菌及芽孢杆菌。 能同化烃类的微生物不宜用此法。,砂土管保藏法 原理：干燥、缺氧 方法：取河砂若干，24目过筛10%HCl浸泡24h水洗至中性烘干后分装安瓿瓶或试管，加棉塞1kg/cm、23分钟无菌检查每管加孢子悬液，接种环拌匀干燥器中干燥火焰熔封或蜡封干燥器中保藏 说明：适于保藏霉菌和放线菌孢子

10、及芽孢杆菌 时间210年,真空冷冻干燥法 原理：低温、干燥、真空（缺氧） 方法：将菌种用保护剂制成菌悬液，先在极低温度下快速冷冻，再在极低的温度下抽真空干燥，使其中的水分直接升华为水蒸汽，以达干燥的目的。 常用的细胞保护剂：血清、脱脂牛奶、淀粉、葡聚糖 说明：目前最有效的保藏方法。 适于细、放、酵、霉、病毒的保存。 保存时间120年。 存活率高、变异率低，但手续麻烦，且需一定设备条件。,液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（ -196）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不

11、乱以及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）,国内外菌种保藏机构：,几种常用菌种保藏方法的比较,3 显微镜下的微生物,原核微生物指细胞核无核膜、无核仁，没有染色体，不进行有丝分裂的微生物。,真核微生物指具有完整的细胞核、有核仁、核膜、染色体，能进行有丝分裂的微生物。,一、细菌和古生菌,定义：细菌是一类细胞细而短（细胞直径约0.5um，长度约0.55um）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。 生存环境：温暖潮湿、富含

12、有机物的地方，都有大量细菌活动。有特殊的臭味或酸败味，发粘、发滑。,1、细菌的形态和排列,细菌的形态,（1）球菌,形状：球形（独存）或近似球形（几个连在一起，稍扁） 大小：0.51m 分裂与排列：,单球菌,细胞分裂沿一个平面进行，新个体分散而单独存在. 如尿素微球菌(Micrococcus ureae),双球菌：,细胞沿一个平面分裂，新个体成对排列. 如肺炎双球菌 (Diplococcus pneumoniae),链球菌：,细胞沿一个平面进行分裂，新个体不但可保持成对的样子，并可连成链状. 如： 乳链球菌 （Streptococcus lactis） 无乳链球菌（Streptococcus a

13、galactiae) 溶血链球菌 （ Streptococcus hemolyticus),四联球菌：,细胞分裂是沿两个相垂直的平面进行，分裂后每四个细胞特征性地连在一起，呈田字形. 如四联微球菌 （Micrococcus tetragenus）,八叠球菌：,细胞按三个互相垂直的平面进行分裂后，每八个球菌特征性地连在一起成立方体形. 如藤黄八叠球菌 （Sarcina ureae),葡萄球菌：,细胞无定向分裂，多个新个体形成一个不规则的群体，犹如一串葡萄。 如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 白色葡萄球菌（Staphylcoccus albus),（2）杆菌(baci

14、llus)及其排列状态,杆菌是细菌中种类最多的类型,因菌种不同,菌体细胞的长短、粗细等都有所差异。 杆菌的形态：短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、“八”字状等。,短杆菌,长杆菌,梭状芽孢杆菌,大小：15m0.5m 形状：主要杆状或圆柱形。 其它：青烟状、弧状、胡萝卜状、大脑骨状、分枝状、丝状 分裂：二分分裂； 折断分裂断面不规则，子细胞大小不一； 出芽分裂 排列：链状；栅栏状；八”字状；分散随机排列 Bacterial shape,Bacterial shape,Scanning electron m icrographs illus

15、trating external features of the rod-shaped bacterium E. coli.,Rod shape is called Bacillus. Two bacilli together - Diplobacilli Chains of bacilli are called Streptobacilli Palisades - Rods side by side or in X, V or Y figures,杆菌(bacillus)及其排列状态2,杆菌端部形状,半圆形 钝圆形 平行 线形,杆菌端部特征,Bacillus megabacterium,Le

16、gionella pneumophila (causes Legionnaires Disease),(causes anthrax), Bacillus anthracis,Rod-Shaped Bacterium, hemorrhagic E. coli, strain 0157:H7,（3）螺旋菌(spirilla),螺旋状的细菌称为螺旋菌。根据其弯曲情况分为：弧菌（vibrio)：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形 例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌(spirillum)：螺旋满26环，螺旋状 例：干酪螺菌 螺旋体(spirochaeta)：旋转周数在6环以上，菌体柔软。 例：梅毒密螺旋体,V

17、ibrio cholerae,杆菌是细菌中种类最多的，工农业生产中所用的细菌大多是杆菌，如淀粉酶、蛋白酶生产菌-枯草杆菌，谷氨酸生产菌-北京棒杆菌，细菌肥料-根瘤菌，杀虫剂-苏云金杆菌，致病菌-伤寒沙门氏菌，痢疾志贺氏菌等。 细菌应用：工业上生产各种氨基酸、核苷酸、酶制剂、乙醇、丙酮、丁醇、有机酸、抗生素等；农业上用作杀虫菌剂、细菌肥料的生产和在沼气发酵、饲料青贮等方面的应用；医药上如各种菌苗、类毒素、代血浆和许多医用酶类的生产等；以及细菌在环保和国防上的应用等，都是利用有益细菌活动的例子。 细菌危害：人、动物、植物的传染病、食物和工农业产品腐烂变质。 2、古生菌 与细菌有着类似的个体形态，但

18、多生活在极端环境中如高温、高盐、,二、真菌,真菌包括的种类极其繁多，且形态、大小各具千秋，既有形体微小的单细胞酵母，也有个体较大、结构复杂的多细胞例如磨菇等，真菌中酵母和霉菌研究较为详细。,1 霉菌(molds),霉菌(mould)是一些丝状真菌的通称，并不是分类学上的名称。在自然界分布很广。大量存在于中性或偏酸性土壤中。,概念 分类位置 分布 应用 危害,（1）霉菌的形态结构,霉菌的菌体由分枝或不分枝的菌丝（hyphae)构成。许多菌丝分枝连接，相互交织在一起所构成的形态称菌丝体（mycelium)。 少数霉菌（根 毛）菌丝无隔膜，属多核的单细胞（低等真菌） 多数霉菌（曲 青）菌丝有隔膜，多

19、细胞（高等真菌），隔膜中央有小孔，使各细胞间的细胞质养料相互沟通。 在固体培养基上，菌丝分化为基内菌和气生菌丝。,霉菌菌丝类型,按分化程度分： 依 形 态 分：,1)营养菌丝(Vegetatile hypha): 在固体培养基上伸入基内的菌丝. 行吸收养料之功能.,2)气生菌丝(Aerial hypha): 向空中生长的菌丝. 发育到一定阶段可分化成 孕育（繁殖）菌丝（Reproductive hypha）.,霉菌（青霉）的菌丝,霉菌菌丝类型,依 形 态 分： 按分化程度分：,无隔菌丝： 为长管状单细胞，细胞质内含多个核。 其生长表现为菌丝的延长和细胞核的增多。 这是低等真菌所具有的菌丝类型。

20、,有隔菌丝 菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，菌丝由多个细胞组成，每个细胞内有一至多个核。隔膜上有单孔或多孔，细胞质和细胞核可自由流通，每个细胞功能相同。这是高等真菌所具有的类型。,菌落特征：霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。,液体培养时的特征： 如果是静止培养，菌丝往往在液体表面生长，液面上形成菌膜。 如果是震荡培养，菌丝可相互缠绕在一起形成菌丝球，亦可形成絮片状，与震荡震荡速度有关。,霉菌的培养特征,（2）重要的代表霉菌,与人类的关

21、系非常密切。日常生活中衣物、食品的发霉现象、酿酒（根）、制酱（曲）、 做腐孔（毛霉）、生产抗生素等。霉菌是人们在实践活动中认识最早并加以利用的一类微生物。,（一）根霉（Rhizopus),分类地位 分布 形态特征 繁殖方式 代表种 应用,根霉,结构特点：菌丝无隔膜的单细胞，在培养基上生长时，由营养菌先生出葡萄枝，再由葡萄菌丝生出特有的分枝状假根，在假根看生处相对长出直立的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，内生孢子，有半球形的囊轴，有囊托。 用途：酿酒 小曲饼中有 生产葡萄糖 淀粉（100%）葡萄糖,（二）毛霉（Mucor),代表种： 总状毛霉、高大毛霉、 鲁氏毛霉、梨形毛霉,毛霉,结构特点：菌

22、丝无隔膜的单细胞，无假根，无葡萄枝，由菌丝体直接长出孢子囊梗，顶端膨大形成孢子囊，内生孢子。囊轴与囊梗相连处无囊托（不分隔） 用途：具蛋白酶 、有较强的分解大豆的能力，用作制腐乳，豆豉；产淀粉酶 、活力强，能将淀粉转化为糖，作糖化菌。,sporangiophores no rhizoids aseptate hyphae,（三）曲霉(Aspergillus),Aspergillus variecolor,曲霉,结构特点：菌丝有隔膜的多细胞，某些菌丝细胞特化膨大形成足细胞。由足细胞处生出分生孢子梗（无隔膜），顶部膨大成顶囊，顶囊表面以辐射状着生一到二层小梗，小梗顶端着生成串的分生孢子，分生孢子呈

23、红、 绿、 棕、 黑等各色，常使菌落呈各种色彩，为鉴定依据。 主要种类： 黑曲霉 重要的糖化菌 、柠檬酸、 葡萄糖酸生产菌。 黄曲霉 可用来生产淀粉酶 、某些菌能产黄曲霉毒素是一种超剧毒致癌物，易在花生、 玉米上形成。 米曲霉 可用作生产淀粉酶,Aspergillus flavus,Aspergillus,Aspergillus fumigatus,（四）青霉（Penicillum):,青 霉,结构特点： 菌丝为有隔膜的多细胞，无足细胞、假根及葡萄枝。由菌丝生出分生孢子梗（有隔膜）顶端不膨大形成顶囊，而是经多次分枝形成扫帚状分枝，顶端 产生成串的分生孢子，一般呈兰、 绿色。 用途：某些种能产抗菌素（如P.C）,paintbrush arrangement of conidiophore smaller than Aspergillus no vesicle septate hyphae,Aspergillus flavus（黄曲霉） Asp.niger（黑曲霉） Mucor mucedo（高大毛霉） Rhizopus oryzae（米根霉） Pencillinm chrysogenum（产黄曲霉） Neurospora crassa（粗