09生物物理技术3章1

1、利用处于电子激发态的分子将激发能以荧光形式释放的特点，测定其辐射特性，从而了解分子性质的技术.,第三章 荧光发射光谱术,生物物理技术,第一节 荧光发射的基本原理 第二节 荧光测量 第三节荧光分子与影响荧光的因素 第四节 在生物医学中的应用 第五节 激光扫描共聚焦显微术,一、基本概念 二、荧光的产生,第一节 发射的基本原理,吸收 分子吸收外来光子后的产生跃迁. 吸收一般发生在10-15秒时间范围内.,一、基本概念,内转换 主要是分子内的非辐射能量转换过程，从各种激发态通过这种方式到达第一电子激发态的最低振动能级的跃迁，通常发生在10-10秒内.,包括S1中不同振动能级以及从S2等更高的电子激发态

2、发生的跃迁.,激发态的分子将通过各种途径丢失能量，最终回到基态.,从第一电子激发态的最低振动能级向基态的不同振动能级跃迁时，能量可以光子形式释放，这被称为荧光，常发生在10-9秒内.,与吸收相似，荧光不只是一种波长而包含有一个频带，即荧光谱都包含有不同的波长范围.,二、荧光的产生,如果激发态和基态有相同或接近的振动能级分布，则发射光谱也有峰. 峰位附近的发射强度逐渐减弱，由于吸收后消耗部分能量，只从S1的零振动能级发射，因此荧光发射谱与吸收谱比较，其峰位产生红移，即向长波方向移动.,此外由于处于不同振动能级的几率相近，使同一物质的吸收谱与荧光发射谱具有镜像对称的性质.,一、荧光测量装置,二、荧

3、光测量中的主要参量,第二节 荧光测量,滤片荧光计：采用滤片做单色器,荧光分光光度计：采用两个单色器,测量装置原理框图,设备外观图,一、荧光测量装置,1. 荧光强度与荧光量子产率 2. 荧光光谱 3. 荧光寿命 4. 荧光偏振,二、荧光测量中的主要参量,荧光强度（F）： 一般具有相对的意义,因为它和被测物质的性质、浓度、环境条件以及测量条件有关. 常与某一标准物质相比较而得到一个相对值，在作图或定量时可用任意单位表示.,1荧光强度与荧光量子产率,当浓度足够大时，F值接近恒定，而在浓度很小时，荧光强度与浓度呈正比. 荧光强度与浓度的,强度与浓度的依赖关系：,荧光强度与浓度的关系,依赖关系，实际上由

4、于其它淬熄过程的影响，荧光强度与浓度的依赖关系常如虚线所示.,荧光量子产率：,由于被吸收光子有可能通过其它途径消耗能量，并不一定全部转变为辐射，因此 常为小于1的数值.,注意： 荧光量子产率和荧光强度是两个不同的概念，前者说明发光的几率，后者说明发射的量子数.只有在用相同的光强激发不同物质时，才能说 大的物质荧光强度也大.,荧光量子产率 和物质本身的性质、溶剂、激发波长与温度等有关.表列举了几种物质在适当溶剂中的 值.,荧光测量了第二个重要方面是荧光光谱的测定，包括谱形与峰位的测定，这是因为谱形与峰位都与分子本身性质及其存在状态密切相关之故. 所谓荧光光谱，包括荧光激发谱（excitation

5、 spectrum）与荧光发射谱（emission spectrum）.,2荧光光谱,荧光法比吸收法优越之处： 有激发和发射两种光谱可以利用. 当两种不同物质在同一波段都有吸收，但发射谱不同，则可以根据发射谱加以区别. 例如蒽和奎宁在330nm附近都有吸收，但它们的发射谱不同，因而可以区分. 同理，当两种物质的发射带重叠时，也可以根据激发谱加以区别.(三种谱),分子在吸收光能后到发出荧光之间有一定的时间间隔. 同一种物质分子的这一时间间隔并不完全相同，其规律是在一定时间内将有一定比例的激发分子发射荧光. 这与放射性核素的衰变规律相同，因此可用一种荧光物质激发态寿命即荧光寿命表示，即经过时间后,

6、荧光强度降为原来的1/e： I=I0e-t/,3. 荧光寿命,荧光寿命不仅取决于分子本身，还和荧光分子所处的环境以及和其它分子相互作用有关. 因此它是一个很重要的参量，但其测量比较困难，因为荧光寿命一般都在10-9秒左右，需要应用快速的电子设备与探测器.(几种物质的荧光寿命),光是一种电磁波,其中包含电场与磁场变化，两者互相垂直. 只考虑电场E时，E的变化限于由E和c组成的平面内. 如果迎着光传播方向观察，则E在一直线内. 通常实际光线中将包含有各种不同的振动. 若光波中的各种E 均匀分布于各个方向，就称为自然光. 如果光波中的E 都在同一平面内变化, 这种光就称为平面偏振光或称线偏振光.如果

7、各个方面强度不同，在某一方向的E占有一定的优势，这种光称为部分偏振光.,4.荧光偏振,荧光偏振就是指物质在受激发后所发射的荧光常为偏振光这样一种性质.在实际测量时，在激发光路与发射光路中各放一个偏振片，即可观察荧光的偏振情况（荧光偏振度、荧光各向异性）.溶液中的分子，其分布是随机的,而且从吸收到发射的时间间隔内，分子本身已经产生转动，因此荧光偏振的程度将因此减小，所以荧光偏振也常被称为荧光消偏振. 因此荧光偏振的研究有助于研究分子的运动.,一、荧光分子,二、影响荧光的因素,第三节 荧光分子与影响荧光的因素,能发荧光的分子. 一般都具有较低的电子激发态 例如用来激发的光子能量小于220nm或55

8、0kJ/mol.,一、荧光分子,天然的荧光分子： 芳香氨基酸、吡啶核苷酸（还原型）、吡哆醛、黄素、维生素A、卟啉、叶绿素、甾族化合物和tRNA中Y碱基（二氢尿嘧啶）等.,生物医学中有重要意义的发荧光分子,为具有共轭双键的系统，其中电子有较大的活动性.,但也并非所有这类双键系统都能发荧光. 例如核酸中的碱基实际上不发荧光（荧光量子产率极小），卟啉能发强荧光，但它和Fe的复合物（正铁血红素）则否，这可能与激发能容易通过非辐射性过程丢失能量有关.,核酸和核苷酸、脂、碳水化合物、羧酸与羧酸酯、非芳香氨基酸和一般的金属离子.,在生物医学中不发荧光的天然物质：,由于能发荧光的生物分子相对来说数量不多，限制

9、了这一方法的应用.,荧光探剂,人们广泛地利用一些能产生稳定荧光的小分子，把这些小分子和大分子结合起来，或者插入到大分子之中，根据这些较小的荧光分子荧光性质的改变,分析大分子的结构、有序性以及其它物理性质，从而使荧光技术得到了迅速发展，应用范围大大扩展.,荧光探剂的种类很多,而且不断出现新探剂以适应各种研究工作的需要.,荧光探剂的吸收带常在330nm以上,故不与生物分子的吸收重叠.,荧光探剂的荧光量子产率与溶剂极性相关： 例：ANS在水、80%乙醇、丙酮与丁醇中的 值分别为0.004、0.11、0.39与0.6，这四种溶剂的极性是逐渐减小的，而 值则逐渐增大，利用这一性质可以大致测出ANS和大分

10、子结合部位的极性. 与此同时峰位也有变化，如ANS在水中的峰位为520nm，在丙酮中则为420nm，这一性质也常用于微环境的极性测定.,荧光检测具有很高的灵敏度，只要检测器的灵敏度足够高，则不需要很多分子发光即可加以检测. 与吸出测量相比，荧光方法的灵敏度一般要高出千倍左右，这是它的优点.,二、影响荧光的因素,另一方面，发光很容易受到各种因素的影响，例如温度，杂质的存在以及pH等. 因此为了得到准确的结果，实验过程需注意考察这些因素的影响.,荧光物质因吸收光能使某一键断裂的现象称为光化分解，其结果常导致荧光逐渐减弱. 表为0.01g/ml硫酸奎宁在紫外线照射后不同时间荧光相对强度的变化.,1光

11、化分解,避免光化分解的措施： 1）如果样品激发谱有一个以上的激发峰，则一般选最大波长的激发峰作为激发光. 2）样品在用激发光照射后立即进行测量. 3）标准溶液尽可能保存在棕色瓶，以避免实验室灯光和和日光照射. 由于稀溶液的光化反应比较严重，因此用浓溶液作贮备液，使用前临时稀释.,由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬熄.产生淬熄的原因很多,主要有以下几个方面: 1）温度淬熄 2）浓度淬熄 3）杂质淬熄,2淬熄或淬灭,正是由于各种淬熄因子的存在，在利用荧光测定某种物质含量和检查其是否存在时，需小心去除可能产生淬熄作用的因子，对所使用的试剂、样品等也都有较高的要求. 但另一方面，淬熄作

12、用常常有特异性.例如卤化物显著淬熄奎宁的荧光，而对其它物质则淬熄作用很小. 因此淬熄是研究分子结构变化的一种手段.,同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光发射峰的位置和荧光强度往往不同. 这是由于荧光分子和溶剂的相互作用所产生的，称之为溶剂效应.,图例,3溶剂的影响,如荧光物质为弱酸或弱碱时，溶液的pH值的改变常对其荧光强度有较大的影响. 因此弱酸或弱碱的荧光物质，例如奈酚或奎宁，常可作为浑浊溶液或有色溶液中和滴定的荧光指示剂. 利用这些物质在不同pH值溶液中的荧光强度的改变判断滴定的终点.,4pH影响,第四节 荧光技术在生物医学中的应用,自从20世纪50年代制成荧光分光光度计之后，它在生物医学

13、中的应用就逐渐被人们所认识，包括氨基酸、蛋白质、核酸、维生素、酶、各种代谢物、药物、毒物等等都可以用这种技术测定. 由于这种方法的灵敏度远大于吸收光谱术，因而日益受到重视. 但在当时，从方法方面看，应用还比较，主要用在对提取后物质的检测、定量等等.,20世纪60年代由于分子生物学的发展，更多地应用荧光光谱的变化、偏振与寿命等这样一些重要指标，研究分子之间的相互作用、分子结构变化与能量传递关系，并且广泛应用了荧光探剂，扩大到生物膜的研究.,在20世纪70年代后这项技术发展特别迅速，与显微镜技术结合起来，深入到单个细胞中各种物质的检测及其相互作用. 目前荧光分光光度技术已经成为生理、生化、生物物理

14、、药理、免疫学、细胞学、卫生学与临床医学各科普遍使用的技术. 它的巨大作用还在不断为人们认识之中. 由于这项技术在各学科中都有广泛应用，因此不可能一一列举，这里仅从方法学角度介绍其在各方面应用的可能性.,一、荧光物质的探测 二、荧光分光光度技术在分子生物学 中的应用 三、荧光分光光度技术在细胞生物学 中的应用 四、三个临床应用实例,生物体内的荧光物质，以及具有荧光性质的外来物质种类繁多，包括氨基酸、胺及其代谢物、蛋白质、辅酶、甾类化合物、维生素,以至体内的无机成分、药物、毒物（包括致癌物质）等等.由于这些物质都具有荧光，因此只对血、尿、血清、组织及蛋白水解产物进行适当处理、提取和分离，即可根据

15、其荧光性质进行辨认，而在与标准物进行对比后，即可对欲测物质定量.,一、荧光物质的探测,荧光检测的优点： 分离要求不高，在经过一定处理和分离后，即使有其它他物质存在，只要不影响待测物质的荧光,就不必进一步纯化. 此外，如果有其它荧光物质存在，只要和欲测物质的光谱相隔甚远，也可以不必进一步分离. 荧光测量法比较迅速,测量方法简便. 由于荧光测量法的灵敏度较高，测量所需要的样品量比较小.,1.利用荧光物质本身的荧光谱进行检测 2.利用荧光衍生物进行检测 3.动力学测定 4.偏振的应用,这方面的工作开展最早，应用最广，到目前为止仍占很大比重. 通常都充分利用荧光分光光度计的特点，从激发谱与发射光谱两方

16、面，结合其在不同条件下以及不同溶剂中的表现加以分析.(例),在检测中常可和用不同环境条件对荧光谱的影响加以验证.,1.利用荧光物质本身的荧光谱进行检测,广泛使用的荧光胺是一种可以和各种氨基酸结合的物质. 因此先由氨基酸分析仪分离各种氨基酸成分，然后分别与荧光胺作用即可测定各种非荧光氨基酸含量. 用此法样品只需1g，可测至50pmol/L.,有些物质不具有荧光，或者荧光量子产率太低不易测量. 这时可以利用某些特异反应使其产生荧光衍生物，或者将荧光改变到易于测量的范围，这样就使荧光方法使用的范围扩大.（例）,2利用荧光衍生物进行检测,在某些生化反应中，某一物质的浓度可根据一段时间内产物荧光变化速率

17、加以测定，称为动力学测定法. 这种方法特别适用于酶反应.只要将反应中各物质的浓度保持固定，则荧光基团形成速率应与欲测物浓度有关. 如果事先做好欲测物不同浓度下荧光变化的速率与浓度的关系曲线（标准曲线），再把待测物质存在时的速率与标准曲线相对比，即可求出待测物浓度.（例）,3动力学测定,生物对象的荧光常呈现一定的偏振性. 在不同的环境或生理条件偏振度的改变与环境或病理状况有关，这样就可以利用偏振作为一种指标加以应用.,4. 偏振的应用,荧光素二醋酸酯(FDA)是不发荧光物质，它在进入淋巴细胞后被酶水解释放出荧光物质荧光素，其偏振程度反映了胞浆的有序程度(structuredness of cyt

18、oplasmic matrix, SCM). 在不同物质刺激下，不同的细胞偏振度变化是不相同的.（例）,1.能量转移的研究 2.结合研究 3.荧光探剂的应用,二、荧光分光光度技术在分子生物学 中的应用,设S、A为两种不同分子，用S能吸收的光激发,则S处于激发态，但当有A在近旁时，S的激发能常能转移至A使之成为激发态，而产生A所特有的荧光，这种现象称为敏化荧光；或者A*通过淬灭而消耗能量.,1能量转移的研究,条件： 供能者能发荧光 供能者的荧光光谱应与受能者吸收光谱有足够的重叠. 供能者与受能者必须足够接近.,应用,小分子与大分子结合是研究药物与受体、抗体与抗原、酶和底物等重要生化活性物质的基础

19、，在结合时小分子或大分子的荧光参量发生变化，利用这些变化可以了解大、小分子的结合.,2结合研究,如果药物在与大分子结合后，荧光强度无变化而偏振度有变化，或着荧光反而被淬灭. 例如抗肿瘤药喜树碱在和人血清清蛋白结合后P 值有明显变化. 消炎药苯丁唑酮能淬灭血清清蛋白的荧光.,某种结合物的荧光性质是否因加入其它物质而改变，可以作为竞争结合的判据. 例如苯丁唑酮加入到血清与喜树碱的结合物中偏振值不变，而双香豆酚加入到该结合物中P值下降，说明双香豆酚可取代喜树碱在清蛋白上的结合部位.,已经介绍过荧光探剂的基本性质和常用于生物医学中的一些荧光探剂. 在分子生物物理和膜生物物理中，广泛应用了各种荧光探剂研

20、究大分子或膜局部微环境的极性、结构、分子运动、结合状况，也利用能量转移原理测定基团之间的距离、监测膜的融合等等，应用的范围十分广泛. 因此在这里把所有与荧光探剂应用有关的问题都归纳在一起，而以几个具体实例来说明其用途与重要性.,3荧光探剂的应用,研究细胞内的荧光物质，或者能用荧光方法测定的物质是细胞生物学中最新发展起来的一项技术，与一般荧光分光光度法一样，它对细胞本身的结构与功能研究具有重要意义.由于研究对象是细胞(单个或群体)，因此它是一种微观的方法，必需和显微镜结合起来使用. 这种方法最突出之点是灵敏度高.,三、荧光分光光度技术在细胞生物学中的应用,细胞分光光度计 把显微镜与荧光分光光度法

21、结合起来的一种技术.,荧光显微镜,使用荧光物质标记细胞中的特定结构，可使图像与背景的对比度增强.,宏观与微观分光光度技术测量下限的比较,1. 细胞内DNA含量的测定 2. 染色体的研究 3. 淋巴细胞表面免疫球蛋白的研究 4. 膜成分扩散速率的测定,由于DNA能和多种荧光物质结合，对于一个细胞核来说，DNA含量越高则结合荧光物质越多，荧光也越强. 根据这一原理可以测定核中DNA的含量. 由于细胞各体间的差异，一般需要测定一定数量的细胞，将相同强度的细胞个数合并计算，然后作出相对荧光强度与细胞个数的直方图. 这种方法对于研究细胞周期及其在各种药物作用下的变化有着重要意义. 因上述方法比较繁琐，又

22、发展了流式细胞仪.,1细胞内DNA含量的测定,用荧光探剂与细胞内染色体中DNA结合，通过显微镜可以观察染色体的形象. 用细胞荧光分光光度计可以准确测染色体各部分DNA的分布情况(图). 这样就在染色体的配对、辨认以及畸变研究创造了较好的条件.,2. 染色体的研究,外周血正常淋巴细胞表面有和膜结合的免疫球蛋白(Ig)，成为与抗原作用的受体部位，用细胞荧光分光光度法可以定量测定单个细胞表面的Ig. 方法是先将荧光素与Ig的抗血清连接然后进行反应，并测每平方毫米面积的荧光强度.,3. 淋巴细胞表面免疫球蛋白的研究,双层膜中的脂分子或蛋白质分子能在膜平面内进行扩散，一般称为侧向扩散. 这类研究对于了解

23、膜的物理性质以及细胞内成分(如微丝与微管)间的关系有很大帮助.,4. 膜成分扩散速率的测定,荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching，简称FRAP；或 fluorescence photobleaching recovery，简称FPR)，是能测扩散系数的一种较好的方法. 其原理是用荧光探剂先标记膜上欲研究的脂分子或蛋白质分子，然后用一束激光通过显微镜系统短时间照射细胞表面的某一小区(其直径为几个m)，在强激光照射下，荧光分子将被破坏，以致此区见不到荧光.,但由于此区以外的荧光分子可以逐渐向此区内扩散，因此再用微弱激光观察时，可以见

24、到此区的荧光强度逐渐恢复，其速率将与分子的扩散速率有关. 从测定结果来看，脂类分子的侧向扩散系数一般10-8cm2/s数量级，蛋白质分子扩散系数一般在10-10cm2/s或更小. FPR法为第一次直接测定膜上分子的扩散提供了定量手段.,1. 5-羟色胺及其拮抗剂和组织胺在心肌缺血中的作用的研究,2.尿毒症患者血浆5-HT变化意义,3.流行性出血热病毒对正常人骨髓细胞致病变作用,四、临床应用实例,问题的提出：为什么要做这项研究？,无症状心肌缺血(SMI)和心绞痛是冠心病发生过程中的两个现象，内源性化学致痛物质、心血管活性肽、神经末梢释放的调节肽在其发生中起着重要作用. 有文献报道：-内啡肽、缓激

25、肽、腺苷等物质参与了SMI和心绞痛的发生. 镇痛物质-内啡肽在SMI和心绞痛的发生中起不同作用.,5-羟色胺及其拮抗剂和组织胺在心肌缺血中的作用的研究,(中华心血管病杂志，1995，23(1)：40),本研究期望从致痛的角度出发，探讨与疼痛调节有关的化学物质5-羟色胺(5-HT)和组织胺在SMI和心绞痛发生中可能存在的不同作用，并用5-羟色胺拮抗剂(赛庚啶)进一步观察5-羟色胺的致痛作用.,组织胺、5-HT均属单胺类物质，在神经末梢可引起伤害性刺激.,对象： 无症状心肌缺血(SMI)组 15例 无心绞痛发作史 心绞痛组 11例 有典型心绞痛症状发作 心电图运动试验阳性,以上病人经冠状动脉造影证

26、实至少有一支冠状动脉管径狭窄50%.,方法 心电图运动试验: 采用常规次极量踏车运动试验.心肌缺血的诊断标准为运动中和运动后心电图出现ST段下垂型或水平型压低1mm，持续时间为2min. 根据运动中自觉症状分为SMI和心绞痛.,采血 运动前休息30min，抽取肘静脉血作为基础水平，运动后立即抽肘静脉血作为运动后水平，低温分离血浆后待测. 5-羟色胺拮抗剂赛庚啶实验组为心绞痛组中的例，服用赛庚啶3日后,再做运动试验.,血浆5-羟色胺用荧光法测定,5-羟色胺在强酸中与邻苯二甲醛(OPT)反应产生一种特异荧光缩合物，其激发波长356nm，发射波长480nm. 另配制不同浓度5-羟色胺标准液.（江苏医

27、药，1985，（12）：24）,SMI组、心绞痛组和对照组运动试验前后 血浆5-HT、组织胺含量的变化,6例服用拮抗剂后，5-HT含量无明显差异(没升高)，心绞痛症状消失.,结果,荧光法测定血浆5-HT,尿毒症患者血浆5-HT变化意义,（中华肾脏病杂志，1997，4）,推论 尿毒素物质排泄，使血小板激活得到控制或体内单胺氧化酶活性得到增强，减少5-HT释放和加速分解. 5-HT可使入球小动脉收缩，5-HT升高既是结果也是恶化原因.,实验发现血液透析后5-HT下降，一段时间后又上升，肾移植后，5-HT可下降至正常.,目的 为了解流行性出血热病毒(EHFV)对正常人骨髓细胞致病变作用的机制，应用物

28、理、组织化学和观察形态学变化等方法，对EHFV感染的骨髓细胞进行研究.,流行性出血热病毒对正常人骨髓细胞致病变作用,（中华传染病杂志，1994，12（3）：131）,材料 髓细胞,方法： 细胞膜脂流动性检测 将培养1、6、24和72小时的髓细胞进行膜脂流动性测定,细胞形态和细胞膜外表变化观察: 分别将培养3天、1周和2周感染EHFV和对照培养的髓细胞固定后，超薄切片做电镜扫描.,细胞内EHFV抗原分布的检测 采用免疫电镜方法，胶体金-A蛋白与抗原结合，观察抗原分布. 髓细胞经处理，超薄切片后透射电镜观察.,结果 EHFV感染髓细胞后，细胞膜脂流动性的变化,扫描电镜发现EHFV感染3天的髓细胞表

29、面出现凹陷；感染1周细胞膜出现缺损和空洞，并可见细胞肿胀；对照组细胞膜均完整. 感染2周细胞膜明显破坏，而对照组仅少数表面出现凹陷.,免疫电镜检查发现胶体金颗粒主要沉着在细胞膜上，次为胞浆内. 细胞核内未见胶体金颗粒沉着. 表明EHFV主要在细胞浆内复制，抗原主要在细胞膜上表达.,小 结,荧光的产生,RF-5301PC荧光分光光度计,930型荧光分光光度计,表是奎宁的0.05mol/L硫酸溶液在25下不同波长激发时的 值（以313nm激发时的值作为1）.,荧光量子产率与激发波长有关,对荧光峰位不同的样品，可选择比较接近者作为标准. 0.05mol/L硫酸奎宁的发射峰在458nm，=0.55;0

30、.1mol/L荧光素的NaOH溶液=0.85，峰在525nm；0.01mol/L色氨酸Tris-HCl缓冲液，pH7.0，其=0.13，峰在348nm. 这些都是常用的测 值的标准液.,奎宁的 值与激发波长的关系,几种物质的 值,激发谱： 表示一种荧光物质在不同波长的激发光作用下所得到的同一波长下荧光强度的关系,也就是不同激发波长的相对效率.,测激发谱时，保持所检测荧光的波长区域不变，逐步改变激发光的波长，画出荧光强度与波长的关系即得激发谱. 光谱中的峰位常用ex表示，它代表最有效的激发波长. 如激发谱中有几个峰，则一般选用波长最大者.,发射谱： 在一定波长激发光作用下荧光强度与荧光波长的关系

31、,即荧光中不同波长幅射的相对强度.其峰位用em表示.,酸性Alizarin Garnet的铝复合物的三种谱,A 吸收谱 B 激发谱 C 发射谱,几种物质的荧光寿命之值,荧光偏振度（P） P=（II）/（I + I） 其中I表示起偏器和检偏器都是垂直取向（这时也与样品杯的垂直位置平行）时的荧光强度，I则为检偏器转动90，使之与起偏器取向垂直时的荧光强度.,在不同的激发波长下所测得的P值不同. 一种荧光物质的P与激发波长的关系称为该物质的偏振谱. 利用偏振谱同样可辨认荧光物质中的吸收基团. 图为蕊香红在95%甘油水溶液中的偏振谱及其相应的吸收谱,蕊香红的吸收谱(a)与偏振谱(b),荧光各向异性（A

32、） 表示荧光的偏振在各个方向上不等同现象. A = （II）/（I +2 I） 在分析复杂体系的荧光偏振时，A比P更方便. 荧光偏振与分子的转动、温度以及介质的粘度等因素有关.,探 剂,用 途,硫酸奎宁溶液在紫外线照射后荧光强度变化,温度对荧光有明显影响，一般温度升高时荧光减弱. 温度每升高1，荧光减弱的百分数称为温度系数. 一般荧光物质的温度系数大约为1%，但色氨酸、蕊香红等较大，约为5%.(几种物质的荧光强度与温度关系).,温度升高时，溶质环境的粘度下降，溶剂与溶质分子的动能增大，这就使荧光分子与其它分子间的碰撞几率增大，淬熄的可能性也随之增大，因而荧光量子产率减少. 因此在荧光测量中应尽

33、可能减少不必要的照射时间. 在要求较高时，样品室应有恒温设备.,温度升高使粘度下降，还对荧光偏振值有影响，温度越高，P 值越小.,几种物质荧光强度与温度的关系,曾提到荧光强度与浓度的关系，在溶液较稀时，荧光强度与浓度成正比，浓度增大后，荧光并不是达到饱和，而是反而下降. 这种因浓度增大而使荧光量子产率减小的现象称为浓度淬熄. 因此在研究浓度与荧光关系时，必须检查所测得的荧光值是在曲线高峰前的浓度还是曲线高峰后的浓度（方法是略为减小溶液浓度再测，如荧光减弱则为高峰前的浓度）.,浓度淬熄,产生浓度淬熄的主要原因是由于发荧光分子在样品之中的不均匀分布. 如图所示: 当溶液稀时，均匀分布于样品池中的荧

34、光分子都有机会吸收光子,而在浓溶液中,靠近入射光的面吸收强烈，越进入溶液，发荧光分子分布越少，这种现象称为内滤光效应. 因此在浓度很大时，常不采用一般直角探测方式，而用表面探测的方式. 但这种测量只限于一些特殊情况，例如对完整细胞或复杂的细胞提取物的测量等.,发光分子在稀溶液(a)与浓溶液(b)中的分布,表面测量方式及其荧光强度变化,由于荧光分子以外的其它分子与荧光分子相互作用而使荧光量子产率减少的现象统称为杂质淬熄. 如杂质与荧光分子组合成为新的化合物，使吸收谱发生显著改变，从而荧光强度大为减低.,杂质淬熄,2-乙酰蒽荧光发射谱,实线:n-H环己烷 点线:丙酮 点划线:水,例如致癌物质苯并芘

35、就是具有特征荧光的一种芳香烃. 它在戊烷溶液中的发射峰在403nm，激发峰在381nm；而在硫酸溶液中，发射峰为545-548nm,激发峰有三个，分别为470、493与520nm.如图所示，3，4-苯并芘在硫酸溶液中的激发谱与发射谱，其荧光强度比同浓度硫酸奎宁大3.5倍之多，因此很容易测到0.001g/ml的浓度. 特别是因为许多芳香烃中只有苯并芘具有545-548nm的发射峰，所以如果在50种芳香烃中(各取1L)含有0.04g苯并芘时也能加以探测(图).,一般做法是将收集到的空气尘埃进行层析，将包括苯并芘在内的烃混合物洗脱，溶于浓硫酸，然后在荧光分光光度计中寻找545-548nm的峰，进一步

36、在固定荧光波长条件下设测激发谱，并与标准品的谱进行比较加以肯定.,苯并芘硫酸溶液激发谱 （实线，545nm测荧光）发射谱（虚线，520nm激发）,苯并芘与其它烃硫酸溶液的发射谱,蛋白质的荧光来源于三种芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸与苯丙氨酸. 它们的激发峰分别在348、310、282nm，但由于能量转移现象的存在，在这些氨基酸的混合物中常不能测出某一特定氨基酸或不能加以区别. 例如在人血清清蛋白中尽管这三者之比为1：18：33，而实际上只能测出色氨酸的荧光. 但如在血清清蛋白中加1-亚硝基-2-萘酚，则只有酪氨酸能与其特异作用，生成激发峰为460nm，发射峰为570nm的产物，这样就可以在不进一

37、步分离提取的条件下测酪氨酸.,在乳酸脱氢酶催化下进行下列反应 NADH的ex=340nm,em=460nm. 固定NAD+、乳酸脱氢酶浓度,加不同浓度乳酸盐测出一定时间间隔内（t）荧光的变化（F），作F/t乳酸盐浓度曲线. 根据该条件下的F/t与标准曲线对比即可求出未知的乳酸盐浓度. 同理，在乳酸盐与NAD+浓度固定条件下可测乳酸脱氢酶的浓度.,有人最初用植物凝集素（PHA）、肿瘤碱性蛋白（CaBp）与脑炎因子（EF）此三种物质分别与淋巴细胞温育后测定 P 值变化.,前面曾提到血清清蛋白中尽管色氨酸很少，但由于苯丙氨酸与酪氨酸的荧光光谱和色氨酸的吸收光谱重叠，因而能量被苯丙氨酸和酪氨酸吸收后，

38、却表现为色氨酸的荧光.,在实际应用中，可通过能量的转移效率的测量,求出两基团之间的距离. 在一个大分子上两个发色基团之间的间隔，同样可根据这一原理进行测定.蛋白质分子中能量迁移的距离还可以作为测量分子大小的尺度及其在不同条件下的体积变化的指标，故被称为光谱尺.,免疫球蛋白是Y形的分子，由两个Fab段与主干Fc段组成. 可以应用杂交抗体技术使两个Fab段分别与-DNS-赖氨酸和荧光素结合.由于这二者之间能够进行能量转,移，因此在用荧光素的激发光刺激后，荧光素的值下降，而-DNS-赖氨酸的 值则增大，利用这一方法可测出两个Fab段端点间的距离.,1）EB与DNA的结合 2）研究蛋白质的探剂 3）荧光探剂在膜研究中的应用,EB（溴化乙锭）是一种扁平形状的分子，吸收峰在285nm与479nm，在水中荧光极弱，而在与DNA结合后荧光大大增强（增强20倍左右）.进一步研究表明，EB与核酸的结合发生在两种情况下:一是整个分子插入到双链核酸的碱基对之间，一是EB的N+与链状多（聚）核苷酸的 结合，但后者较弱，在离子强度较大时即可完全排除，因此EB是一种与双链核酸的专一反应性探剂.,1）EB与DNA的结合,利用这一特性可以研究许多问题，例如研究核苷酸之间的杂交反应. 将不同比例的聚腺嘌呤（PolyA）与聚尿嘧啶（PolyU）混合时，荧光强度发