课题3 分解纤维素的微生物的分离.ppt

1、课题3 分解纤维素的微生物的分离,专题2 :微生物的培养与应用,课题目标,1、简述纤维素酶的种类和作用； 2、从土壤中分离出分解纤维素的微生物； 3、讨论这类微生物的应用价值；,研究对象：分解纤维素的微生物,课题重点、难点 重点：从土壤中分离出分解纤维素的微生物； 难点：从土壤中分离出分解纤维素的微生物；,课题背景,1、纤维素：是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖。,2、可被土壤微生物分解利用,纤维素,纤维素酶酶：C1酶、 Cx酶 葡萄糖苷酶,葡萄糖,3、分解纤维素的微生物的利用： 使人们能够利用秸秆等废弃物发酵产生酒精，用获得的纤维素酶处理服装面料等。,纤维素,

2、纤维素酶酶：C1酶、 Cx酶 葡萄糖苷酶,葡萄糖,一、基础知识,（一）纤维素与纤维素酶 （二）纤维素分解菌的筛选,（一）纤维素与纤维素酶:,1、纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖。 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物、木材、秸秆也富含纤维素，许多商品纤维素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基纤维素钠（a）、不溶于水的微晶纤维素等,（一）纤维素与纤维素酶:,2、纤维素酶：一种复合酶，至少包括三种组分 C1酶（外切酶）：又称纤维二糖水解酶，作用于纤维 素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉 两个分子葡萄糖产生纤维二糖； Cx酶（内切酶）：作用于无定型的纤维

3、素区域，使纤 维素断裂成片段；,葡萄糖苷酶：将纤维二糖水解成葡萄糖,纤维二糖,葡萄糖苷酶,葡萄糖（终产物）,小实验：体会纤维素酶的作用,滤纸被分解,不加,10ml,滤纸条,2号试管,滤纸未被分解,2支试管固定在50ml的锥形瓶中，140 r/min转速振荡反应 1h（如无摇床可以采用定时人工振荡的方法）,1ml,11ml,滤纸条,1号试管,观察记录结果,纤维素酶：（70-80U）,醋酸醋酸钠缓冲液：0.1mol/l,滤纸条：1cm6cm,试管编号,小实验：体会纤维素酶的作用,1U表示1个酶活力单位，是指在25，其他反应条件均最适宜情况下（如PH等），1min内转化1mmol底物所需的酶的量。,

4、刚果红（Congo Red,简称CR)染料可以与像纤维素这样的多糖形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。在含纤维素的培养基中加入刚果红时便形成了红色复合物。当纤维素被纤维素分解酶分解后，刚果红 纤维素复合物就无法形成，培养基上会出现以纤维素分解菌为中心的透明圆圈，通过透明圆圈来筛选纤维素分解菌。,（二）纤维素分解菌的筛选,（二）纤维素分解菌的筛选,二、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,取样涂布：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,1、培养基类型：选择培养基 2、培养基特点：纤维素作为碳源。 3、培养基配方：,制备培养基：选择培养基,上述物

5、质溶解后加蒸馏水定容至1000ml,4、培养基的制备： （1）计算、称量：按比例和用量准确称取纤维素粉、NaNO3、Na2HPO47H2O、 KH2PO4、 KCl、 MgSO47H2O、酵母膏、水解酪素备用； （2）溶化：蒸馏水中加入上述药品后搅拌使溶解，完全溶解后补加蒸馏水至1000ml；调pH。 （3）灭菌：将50ml培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹（5-8套为一包），放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。（液体培养基不用倒平板）,制备培养基：选择培养基,1、培养基类型：鉴别培

6、养基 2、培养基特点：加入刚果红。 3、培养基配方：,制备培养基：鉴别培养基,上述物质溶解后加蒸馏水定容至1000ml,4、培养基的制备： （1）计算、称量：按比例和用量准确称取酵母膏、 CMCNa、KH2PO4 、琼脂、土豆汁 备用； （2）溶化：蒸馏水中加入酵母膏、 CMCNa、KH2PO4 、土豆汁后搅拌使溶解充分加入15g琼脂加热熔化，并不断搅拌防，琼脂完全融化后补加蒸馏水至1000ml；调pH,制备培养基：鉴别培养基,（3）灭菌：将适量培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，高压蒸气灭菌，在压力100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿干热灭菌，在160170 下灭菌2h

7、。 （4）加入刚果红(CR):配制10mg/ml的CR溶液，灭菌后，按照每200 ml培养基加1 ml的比例加入CR溶液，混匀。 （4）倒平板：待培养基冷却到50 左右时在酒精灯火焰附近倒平板。（倒平板操作同上节）,制备培养基：鉴别培养基,（一）土壤取样：资料一,1、取样环境： 富含纤维素的环境中，如多年落叶形成的腐殖土、多年积累的枯枝败叶等环境，滤纸埋入图土壤（深10cm左右）30 d左右，从已腐烂的滤纸上筛选。,2、原因： 由于生物与环境的相互依存，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。 滤纸埋入土壤是人工设置纤维素分解菌的事

8、宜环境，使纤维素分解菌相对密集含量提高；埋入深度约为10cm左右。,旁栏思考:如果找不到合适的环境，可将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应埋进土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,旁栏思考:为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌,由于生物与环境的相互依存，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,（二）选择培养：资料二,资料二：在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上之前，通过选择培养增加纤维素分

9、解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需微生物。请分析旁栏培养基配方，回答问题：,（二）选择培养：资料二,1.选择培养的目的：,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。,2.选择培养基：,（1）特点：以纤维素作为主要碳源（唯一碳源） （2）作用：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。 适合于纤维素分解菌的生存并选择增殖提高浓度； 抑制其他微生物的增殖使其浓度降低或不能增殖,参照选择培养基的比例配置，回答下列问题,（1）旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基；原因是配方中无凝固剂，液体培养基有利于微生物与营养物质充分接触，

10、有利于培养增殖（此处目的不是为了形成菌落，而是侧重于培养增殖浓度提高）,2.选择培养基：,（3）你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？,用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照 预期结果： 牛肉膏蛋白胨培养基：多种微生物可以增殖， 纤维素分解菌的浓度不会提高； 选择培养基：其他微生物浓度降低，纤维素分 解菌浓度提高，得到较好的实验效果,（2）这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有；碳源是纤维素，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖,3.选择培养的操作方法：,在腐殖土、枯枝败叶、腐烂滤纸取土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上（如无摇床，可用定时人工

11、摇晃锥形瓶的办法），在一定温度下振荡培养12天，直至培养液变浑浊（分解纤维素的微生物比例增大） 。吸取一定的培养液（如5ml），转移到另外一瓶新鲜的选择培养液中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。可重复选择培养增加纤维素分解菌浓度使之更高；如样品中纤维素分解菌浓度较高，选择培养可不进行。,旁栏思考：为何选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,1、可使能适应选择培养基的微生物得到迅速繁殖；2、不适应选择培养基的微生物的繁殖被抑制； 因此可以起到“浓缩”的作用,旁栏思考：本实验流程与课题2中实验流程有何异同？,异：课题2：菌液直接涂布在以尿素为唯一氮源的固体 选择培养基上，直接分离获得菌落； 本课题：通

12、过液体选择培养基，使纤维素分解菌得 到增殖浓度提高后，再将菌液涂布在纤维素 鉴别（刚果红）培养基上获得菌落。 同：其他步骤两者基本相同,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106,（三）梯度稀释：,将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在CR鉴别培养基上，30倒置培养,（四）取样涂布：,刚果红染色法：含CR的鉴别培养基,1、筛选原理：,2、资料二：刚果红染色方法 （1）方法一（先培养微生物再加入刚果红进行颜色反应）：在长出菌落的培养基上覆盖质量浓度为1mg/ml 的CR溶液，10-15min后倒去CR溶液，加入质量浓度为1mol/l的NaCl溶液

13、，15min后倒掉NaCl溶液，此时产生纤维素酶的菌落周围将出现透明圈； （2）方法二（在倒平板时就加入刚果红） ：配制10mg/ml的CR溶液，灭菌后，按照每200 ml培养基加1 ml的比例加入CR溶液，混匀后倒平板，等长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将出现明显的透明圈。,方法一缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用 方法二优点是操作简便，不存在菌落混杂问题 缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；缺点二有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明

14、圈，与纤维素分解菌不易区分,旁栏思考：想一想这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种？,（五）挑选产生透明圈的菌落,挑取产生明显透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。 接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯培养。,本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。,三、课题延伸,发酵产纤维素酶的实验,液体发酵,固体发酵,（纤维素酶）,滤纸等纤维素,葡萄糖：定量测

15、定,发酵,1、你选用了哪种实验用品来分离纤维素分解菌?取样环境有什么特点？作出选择的理由是什么？,四、结果分析与评价,腐殖土、多年积累的枯枝败叶、埋入土壤10cm经30d左右腐烂的滤纸；富含纤维素分解微生物；此环境纤维素分解菌浓度高。,2、培养基有杂菌污染吗？你是否分离到了能够产生透明圈的微生物？它们是纤维素分解菌吗？,如空白对照培养基无菌落则说明培养基无污染，否则有污染；分离得到的有透明圈的菌落不一定就是，还要进一步进行发酵产纤维素的实验以证明其真的分解纤维素产生了葡萄糖，并可对葡萄糖作定量测定。,3、比较你的分离结果与其他同学有什么不同？分析产生不同结果的原因？,四、结果分析与评价,由于取

16、样环境的不同，操作过程的差异，不同同学实验结果可能会有差别；如果与大家的结果不同应分析原因： （1）通过对照实验检验培养基是否污染： （2）操作过程是否进行了无菌操作且保证无杂菌污染 （3）选择培养是否使纤维素分解菌浓度提高 （4）梯度稀释的稀释度是否合理 （5）产生的有透明圈的菌落是否就是纤维素分解菌,五、操作提示,（一）复习微生物技术 实验前，请先复习课题1、2中学习过的方法：主要包括 1、培养基制备：计算、称量、溶化（调并分装）、灭菌、 倒平板（液体培养基不用倒平板）； 2、无菌操作技术：环境、操作台、衣服消毒；培养皿、试管、吸管等玻璃仪器、金属用具干热灭菌；接种环、试管口等灼烧灭菌；培养基等高压蒸汽灭菌；操作过程在酒精灯火焰周围； 3、稀释涂布平板法：按微生物浓度梯度稀释，用涂布器涂布； 4、选择培养基的作用：选择培养目的微生物，抑制其他微生物 5、土壤取样：用铁铲取土样装入信封，操作在酒精灯火焰周围，（铁铲和信封已灭菌）,五、操作提示,（二）选择培养的操作方法,土样,如样品中纤维素分解菌浓度较高，选择培养可不进行,P30练习：2：学完这个专题后，你能否总结出分离培养微生物的一般方法？请用流程图表示。,课后练习,土壤取样,选择培养,梯度稀释,取样涂布：