HPLC仪的保养及维护.ppt

1、1,江苏XX科技有限公司质量控制部 2007-12-09,高效液相色谱仪(HPLC)的保养及维护,2,HPLC的环境设置：,HPLC的日常操作条件：温度：1030；相对湿度80； 最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。,3,HPLC用水可以通过以下几个方面来得到：,1 专门的纯水机或超纯水机； 2 去离子水重蒸； 3 二次或三次重蒸水； 4 采用类似家用的纯水机； 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； 6 其它途径；,4,不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机

2、离子及空气等。,5,HPLC六通阀进样器的使用及保养,六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。,6,工作原理,手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出； 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。,7,虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保

3、护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。,8,手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。,9,六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，如20l的定量环最多进样15l的样品，并且要求每次进样体积准确、相同

4、；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。,10,可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10l的定量环，实际是9l还是1ll并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。,11,进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用045m的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中

5、，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。,12,等待进样示意图,13,进样示意图,14,泵的保养：,使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；,15,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中

6、残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；,柱的保养：,16,紫外灯的保养：,在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。 样品池要保养,17,液相色谱日常维护,18,维护流程图,19,管线选择,材料 不锈钢 Teflon PEEK (聚醚酮) 尺寸 0.1 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.5 mmI.D. x 1.6 mmO.D. 0.8 mmI.D. x 1.6 mmO.D.,20,管线材料,不锈钢 (可用于所有连接) 能承受几千 kg/

7、cm2 压力 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时) PEEK (可用于所有连接) 能承受高达 250 kg/cm2压力 可在整个PH范围(pH 1-14)内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等 Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管) 化学惰性大 能承受 5 kgf/cm2 压力,21,吸滤头,材料：不锈钢烧结，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：用异丙醇（或5稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗,22,单向阀,23,单向阀,单向阀结构,球座,单向阀原理,24,单向阀清洗,故障：宝石球或球座受污导致密封不好 表现：系统压力波动大 措施： 打开排液阀，

8、以异丙醇为流动相输液 拆下单向阀，放入异丙醇中（或5%的稀HON3中加热），超声波清洗,25,故障1：宝石球粘附于垫片 表现：泵无法吸液或排液，流路不通 措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗,单向阀粘结,26,柱塞密封圈的更换,故障：密封圈磨损导致密封不良 现象：系统压力波动大或漏液 措施：更换密封圈 注意点： 1）更换前，新密封圈用异丙醇 浸泡15 min 2）拆卸泵头前，柱塞杆复位 （PSET）,27,线路过滤器,故障：堵塞 现象：系统压力波动大或压力 偏高 措施：异丙醇（或5稀硝酸）， 超声波清洗 判断依据：关闭排液阀

9、，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力5kgf/cm2，则堵塞。,28,手动进样器,操作注意点： 1）进样时，进样针应插到底 2）不使用时将针头留在进样器内 3）进样应使用液相色谱专用平头 进样针 4）样品溶液pH小于10, 常用密封垫的材质适用pH10, 否则换特氟隆材质的密封垫pH10-13 5）清洗应使用专用针口清洗器,29,清洗针口,30,HPLC的分离类型,正相色谱 (NP-HPLC) 反相色谱 (RP-HPLC) 反相离子对色谱 (RPIC) 离子交换色谱 (IEC) 空间排阻色谱 (SEC) 手性化合物分离模式(Chiral separation mode),31,正相H

10、PLC色谱柱,硅胶型 氰基型 氨基型 糖类分析 二醇基型 蛋白质分析,Silica gel,Si,Si,-Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH),Modified Si,32,反 相 HPLC 色 谱 柱,C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type,-Si-C18H37,Si,Non-polar property,33,色谱柱:非极性 溶剂: 极性 水 / 甲醇 / 乙腈,反 相 色 谱,34,色谱柱

11、柱效降低原因,滤片或填料堵塞 样品或流动相中杂质吸附 机械振动产生空隙 填料变性,35,滤片或填料堵塞,使用预柱 缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤 样品溶液使用0.45um滤膜过滤 反向连接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液 打开柱头，清洗或更换滤片,Back,36,样品或流动相中杂质吸附,杂质会产生拖尾峰 使用高溶解性溶剂清洗色谱柱,仅 1 cm深度 会被污染,色谱柱,取出污染填料，装填新的填料,37,产生峰变形（如拖尾等）的原因,柱进口污染 柱内存在空隙 样品过载 溶解样品的溶剂选择不当 二次保留效应 担体表面存在硅醇基 担体表面残留重金属,38,溶解样品的溶剂选择不当,最好不要选择高溶

12、解性的试剂作为溶解样品的溶剂,最好注入少量样品,39,溶解性效应,低溶解性溶剂,高溶解性溶剂,Back,40,机械振动产生空隙,不要撞击色谱柱如 色谱柱掉落或柱压急剧变化 。,Back,41,反相色谱分析时 添加10-30 mM 三乙胺(triethylamine) 可以抑制碱性化合物色谱峰拖尾 添加1% 醋酸acetic acid 可以抑制酸性化合物拖尾 三乙胺(triethylamine) 也用于正相色谱中,使硅胶部分去活性, 以获得化合物合适的保留时间,42,紫外检测器,43,检测池清洗,故障：样品池受污 表现：样品池和参比池能量相差较大 检查方法：设定250 nm波长，通甲醇或水，查看

13、SMPL EN 和REF EN，如两者相差较大，则样品池受污 措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中清洗。,44,更换氘灯,判断氘灯能量： 设定220nm波长，检查参比池能量，如能量低于800，需考虑更换氘灯。,2020/9/14,45,液相色谱常见故障,诊状 可能的原因 解 决 方 法 (一)保留时间变化 1.柱温变化 柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积 的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够 用25mmol/L的缓冲液 4.柱污染 每天冲洗柱 5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命 采用保护柱,46,(二)

14、保留时间缩短 1.流速增加 检查泵, 重新设定流速 2.样品超载 降低样品量 3.键合相流失 流动相PH值保持在37.5 检查柱的方向 4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加 柱恒温 (三)保留时间延长 1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈, 排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙 胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失 同前(二)3 4.流动相组成变化 同前(二)4 5.温度降低同 前(二)5,47,48,49,50,泵 的 操 作 与 维 护,正如人的心脏一样,高效液相色谱仪中的高压恒流泵必须能可靠的运转.但是要做到长时间低维护的可靠运转,就需要对泵有

15、足够的了解,并注意与之有关的事项.1.通常的设计 目前作为商品出售的高压恒流泵多为往复式柱塞泵,结构原理如图1所示.凸轮与连杆将电机的圆周运动转变为柱塞杆的线性运动,在有单向阀的结构中,柱塞杆将常压下储液瓶中的流动相吸至泵腔后再送出,其耐压可达41MPa.通过改变凸轮的形状和电机的转速及柱塞杆的尺寸可以将流动相的脉动降至最小.如果对泵的各个部分都有清楚的认识,将来排出操作过程中出现的故障就很简单了.,51,单向阀:泵头通常由两部分组成-单向阀和密封圈-柱塞杆. 是单向阀的示意图.该单向阀一般由阀体塑料或陶瓷阀座和红宝石球组成.在压力的作用下宝石球离开阀座流动相流过单向阀;反之,在反向力的作用下

16、,宝石球回到阀座上此时流动相不再流过单向阀.显然宝石球与阀座之间的配合必须非常适合才能防止流动相的泄漏.为了保证单向阀不发生泄漏,一些单向阀中安装了两套宝石球和阀座,也有一些单向阀是将宝石球用一个合适的弹簧压在阀座上.在不同的应用领域,单向阀阀体的材料有所不同,例如考虑生物兼容性的系统,单向阀的阀体往往采用金属钛,而不用不锈钢.为了降低成本和减少维护费用,一些生产厂商还采用了可置换式的卡套式塑料单元件,当然其功能仍保持不变,52,柱塞杆与密封圈:柱塞杆在泵头内做前后的往复运动,完成将流动相吸入泵头然后再输出的过程.柱塞杆的典型材料蓝宝石,不锈钢或其他材质的柱塞杆往往用于一些特殊的领域.泵头内的

17、密封圈是防止流动相从柱塞杆的周围流走而设计的. 是柱塞杆的运动过程示意图. 在吸液过程中由于柱塞杆的运动而在泵腔内形成负压.此时因色谱柱的,泵头外的压力显然高于泵头内,在这两种压差下出口单向阀的宝石球落回到阀座上;而对于入口单向阀,因为外界大气压大于泵腔内的压力,宝石球离开阀座,流动相顺利的进入泵腔.,53,与此相反的输液过程见图3-b.由于柱塞杆的运动使压力增加,入口单向阀的宝石球落回到阀座,入口单向阀处于关闭状态;当泵头内的压力继续增加,并且超过了泵头外的色谱柱的反压时,出口单向阀开启,流动相输出.,54,进样阀在进样过程中，必须是非常清洁的，否则得不到较好的结果。进样阀切换到进样位置（I

18、nject）后，要在此位置保持一段时间，使流动相充分冲洗样品定量管，这样可以保证有较高的精确度，而且不用另外再冲洗样品定量管。这种由色谱仪器控制的冲洗显然要比手动冲洗更好些。注意：冲洗需要的流动相体积至少为所进样品体积的10倍。例如，如果取20L样品至100L样品定量管中，而流动相此时的流速为1mL/min，则需要在进样位置至少保持12s，即：20L10/1000Lmin-1=0.2min=12s。,55,当样品定量管经过充分的冲洗后，可以将旋柄转回取样位置（Load），也可以继续保持在进样位置，到下次取样前才切换回取样位置。在切换回取样位置时，将样品进样针或微量样品进样针从进样阀中拔出。 为防止交叉污染，正常情况下不必每次进样后都冲洗进样阀注射针导入口。进样阀内根据专利设计的直接连接进样孔，可以使注射针头的前端直接连接到样品定量管的末端，没有其他空间供样品残留。这样在下一次进样时，就不会有上一次残留的样品进入样品定量管。,56,但是在进样针头插入或拔出过程中，会有痕量的样品沉积在针 头密封区域。精密的测定显示这种残留有1nL 10nL。这表明 进20L样品，会残留0.005% 0.05%。每次进样后