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文档简介

1、1,核酸含量测定,定磷法,2,核酸定量测定常见的方法,1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为-羟-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。,3,定磷法的原理,首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为： (NH4)MoO4+H2S

2、O4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 MoO3（钼蓝）,4,还原产物钼蓝在波长660nm测定吸光值，当无机磷含量在125g 范围内，光吸收和含磷量成正比。 RNA的含磷量为9.5%，即1g RNA磷相当于10.5 g RNA。DNA的含磷量平均为9.9%。,5,试剂,酵母RNA样品溶液：2000g/mL 标准磷原液：含磷量为1000 g/mL 标准磷溶液：含磷量为10 g/mL，每组用干试管取15mL 定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100m

3、L烧杯取70mL,6,实验步骤,1. 核酸样品用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷； 2. 制定定磷标准曲线； 3. 测定回收率和样品总磷量。,7,1. 样品消化（每两组或三组做一份）,8,2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份） 每人取18支试管，按照下表平行操作：,9,3. 测定总磷量和回收率（与2同时进行）,10,数据处理,关于空白： 16号管用于绘制定磷标准曲线，1号管作为空白。 79号管用于样品及回收率的测定，7号管作为空白。 以每管含磷量(g)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。 在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(g)。,11,计算回收率： (2) 计算样品

4、总磷量： (3) 计算RNA量： (4) 样品RNA含量：,12,操作注意事项,1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。,13,思考题,1. 回收率的意义； 2. 实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。,14,实验结束,将试管

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