饲料中有毒有害物质的测定.ppt

1、9/11/2020 11:48 PM,1,饲料中有毒有害物质的测定,黎观红 江西农业大学动物科技学院,9/11/2020 11:48 PM,2,9 饲料中有毒有害物质的测定P244,（一）饲料质量 营养质量：饲料营养成分含量； 技术质量：饲料的物理特性、如颗粒大小、形状、硬度、适口性等、混合均匀度； 卫生（安全）质量：对动物、人和环境的安全； 情绪质量：伦理标准或感觉可影响对质量的讨论， 如有争议的动物性原料 或人造着色剂和调味剂。,一、概述,公众对饲料质量重要性的认识的变化 表1,9/11/2020 11:48 PM,3,9 饲料中有毒有害物质的测定,（二）几起典型的饲料安全事故 世纪年代中

2、期至年代中期疯牛病（“牛海绵状脑病” ）的暴发流行。 1999年1月15日以来，比利时、荷兰、法国、德国相继发生因动物饲料被二恶英污染，导致畜禽类产品及乳制品含高浓度二恶英事件。 “瘦肉精”中毒问题、“毒奶粉（2008）”、“红心鸭蛋（使用苏丹红，2006）”、“多宝鱼（药物残留，2006）”等。 “配合饲料有毒”、“配合饲料生产的肉蛋奶不能吃”、“小孩肥胖原因是吃了含激素的肉”。,一、概述,饲料安全等于畜产品安全！,9/11/2020 11:48 PM,4,都是药残惹的祸！,苏丹红,三聚氰胺,疯牛病 二恶英 瘦肉精 三聚氰胺 苏丹红（红心鸭蛋） 孔雀石绿（水产品） 抗生素等药物残留 ,9/1

3、1/2020 11:48 PM,5,“饲料鸡”,“土鸡”,新概念鸡蛋全是“扯蛋”？,9/11/2020 11:48 PM,6,9 饲料中有毒有害物质的测定,（三）饲料卫生标准强制性国家标准 对饲料中有独有害物质及有害微生物以法律形式做出的统一规定。 1991年版饲料卫生标准： 覆盖面较小，造成许多事故纠纷无判定依据，一些重要的产品卫生指标没有规定等。,一、概述,9/11/2020 11:48 PM,7,9 饲料中有毒有害物质的测定,（三）饲料卫生标准强制性国家标准 2001年新版GB130782001饲料卫生标准： 有害物质及微生物卫生指标项目增加了“铬”在皮革、蛋白粉和鸡、猪配合饲料中的允许

4、量指标。即由原标准规定的16项，修订为17项。 新版标准覆盖的产品品种达66种，是原标准的3倍多。 砷在磷酸盐产品中的允许量指标由每千克产品10毫克，修订为20毫克。 氟在磷酸氢钙产品中的允许量指标由每千克2000毫克，修订为1800毫克。 黄曲霉毒素B1指标将肉用仔鸡配合饲料分为前期料和后期料，其允许量分别为每千克饲料中10微克和20微克。 补充规定了与各项指标相对应的试验方法，消除了原标准没有指明特定试验方法的缺陷。,一、概述,9/11/2020 11:48 PM,8,9 饲料中有毒有害物质的测定,（三）饲料卫生标准强制性国家标准 现行的饲料卫生标准将进行不断的修订和完善！ 相对于发达国家

5、的饲料卫生标准，我国的饲料卫生标准项目偏少。 新农药的不断出现（现行饲料卫生标准只规定了两种农药的限量标准：六六六、滴滴涕）。敌敌畏 、敌百虫 、甲胺磷 、菊酯类 、马拉磷 、蚜螨磷安全限量标准草案。 测定方法灵敏度的提高，对于某些有毒有害物质限量的规定将可能发生改变。 新饲料资源的开发利用。,一、概述,9/11/2020 11:48 PM,9,9 饲料中有毒有害物质的测定,（四）饲料中有毒有害物质的分类 1. 按来源分： 天然：棉酚、硫甙、脲酶、胰蛋白酶抑制剂等 次生：微生物次生代谢产物，如黄曲霉毒素B1、由氨基酸产生的组胺、尸胺、腐胺、精胺等 外源性：重金属污染， 2 按性质分： 有机：棉

6、籽饼粕、菜籽饼粕、蓖麻饼粕中的蓖麻毒素和蓖麻碱、四 季豆中的皂甙（皂素）和胰蛋白酶抑制剂等，病原微生物、霉菌毒素、有机农药等。 无机：铅、砷、铬、镉、汞、氟、钼等。,一、概述,9/11/2020 11:48 PM,10,9 饲料中有毒有害物质的测定,砷的毒性：砷与动物体组织中酶的巯基结合使之失活，损害机体全身组织。 砷的氧化物毒性很高，三价砷毒性五价；无机砷毒性有机砷：砒霜（As2O3 ）。 一般情况下，植物性饲料砷含量很低。 植物饲料中砷含量与土壤中的水平、农药污染和工业污染有关。,二、饲料中总砷的测定（P248）,9/11/2020 11:48 PM,11,9 饲料中有毒有害物质的测定,二

7、、饲料中总砷的测定,有机砷饲料添加剂：对氨基苯砷酸（阿散酸）、对氨基苯砷酸钠和3-硝基-4-羟基苯砷酸 （洛克杀生 ）。 促生长，抗球虫及着色（使皮肤红润，毛色发亮）等功效。 我国制定的饲料中砷测定标准方法是测定饲料中总砷含量（目前的检测方法还不能区分有机砷和无机砷），而卫生标准中砷的限量标准为无机砷，造成了使用有机砷添加剂的配合料，含砷量超过我国国家允许量标准，这也使得检测结果无法依据产品卫生标准进行质量判定。,9/11/2020 11:48 PM,12,9 饲料中有毒有害物质的测定,二、饲料中总砷的测定,9/11/2020 11:48 PM,13,9 饲料中有毒有害物质的测定,（一）概述

8、黄曲霉毒素（aflatoxins, AF）是由一组真菌（黄曲霉、曲霉等）产生的一组化学结构类似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其饼粕等。对人和动物均具有极强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素还可在动物产品中蓄积，影响人体健康。 目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。其中黄曲霉毒B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。 在自然条件下，饲料污染的黄曲霉毒素主要为AFB1、B2 、G1 、G2，其中以AFB1含量最高。 黄曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄积性饲料产品质量控制中的必检项目。,二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定,9/11/2020 11:48

9、 PM,14,9 饲料中有毒有害物质的测定,(二)检测方法 酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 薄层层析法（thin layer chromatography，TLC） 快速筛选法,二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定（P288）,9/11/2020 11:48 PM,15,9 饲料中有毒有害物质的测定,酶联免疫吸附法 1、原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 特点： 很强的特异性：建立在抗原与抗体免疫学反应的

10、基础上。 很高的灵敏度：酶催化反应。对于黄曲霉毒素B1，ELISA法最低可检出0.1g。,二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定,9/11/2020 11:48 PM,16,9 饲料中有毒有害物质的测定,酶联免疫吸附法 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物。,二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定,9/11/2020 11:48 PM,17,酶联免疫吸附法 A、抗体 将某种抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆

11、抗体。,9 饲料中有毒有害物质的测定,9/11/2020 11:48 PM,18,单克隆抗体是由生长在细胞培养物中的同一B细胞的群体（一个克隆）合成并分泌的、均一的、识别同一抗原表位的抗体。,9/11/2020 11:48 PM,19,酶联免疫吸附法 B、酶与底物： 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联

12、苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸终止酶反应。 碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。,9 饲料中有毒有害物质的测定,9/11/2020 11:48 PM,20,酶联免疫吸附法 B、酶与底物： 在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等

13、。 辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用2mol/L硫酸终止酶反应。 碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。,9 饲料中有毒有害物质的测定,9/11/2020 11:48 PM,21,酶联免疫吸附法 ELISA最常用的四种方法： 直接法测定抗原； 间接法测定抗体； 双抗体夹心法测定抗原； 竞争法测定抗原。,9 饲料中有毒有害物质的测定,9/11/2020 11:48

14、 PM,22,（1） 直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量抗原量。,9/11/2020 11:48 PM,23,（2）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体； D. 加底物。 测定底物的降解量抗体量。,9/11/2020 11:48 PM,24,（3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。,9/11/2020 11:48 PM,25,（4）竞争法测

15、定抗原 A.将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,9/11/2020 11:48 PM,26,黄曲霉毒素B1酶联免疫竞争检测法,9/11/2020 11:48 PM,27,样品,黄曲霉毒素B1分子,9/11/2020 11:48 PM,28,微 孔 表 面 情 况,AFB1抗体,9/11/2020 11:48 PM,29,标准品,9/11/2020 11:48 PM,30,标准溶液,9/11/2020 11:48 PM,31,酶标抗原,9/11/2020 11:48 PM,32,酶

16、标抗原,酶,AFB1,9/11/2020 11:48 PM,33,标准品, 样品 和 酶标抗原加进微孔,9/11/2020 11:48 PM,34,样品,酶标抗原,样 品 孔,先加,后加,9/11/2020 11:48 PM,35,标准品,酶标抗原,标 准 孔,先加,后加,9/11/2020 11:48 PM,36,孵育30分钟,抗 原 与 抗 体 结 合,9/11/2020 11:48 PM,37,微 孔 清 洗,9/11/2020 11:48 PM,38,洗涤5次，间隔2分钟,9/11/2020 11:48 PM,39,加入酶催化反应底物,9/11/2020 11:48 PM,40,加入反

17、应底物A和B,孵 育 15 分 钟,9/11/2020 11:48 PM,41,显 色,9/11/2020 11:48 PM,42,9/11/2020 11:48 PM,43,反 应 孔,9/11/2020 11:48 PM,44,阴 性 对 照 孔,9/11/2020 11:48 PM,45,阴性对照孔=没有黄曲霉毒素B1分子与酶标抗原竞争 所有抗体都与酶标抗原结合,9/11/2020 11:48 PM,46,阳 性 对 照 孔,9/11/2020 11:48 PM,47,1 ng/ml 标准孔 = 黄曲霉毒素B1分子结合到抗体上 剩余的抗体再与酶标抗原结合,9/11/2020 11:48 PM,48,阳 性 样 品,酶标抗原结合得越少，颜色越浅,9/11/2020 11:48 PM,49,加入终止液，反应液由蓝色变成黄色，上酶标仪读取数据，画标准曲线,9/11/2020 11:48 PM,50,调零孔,阴性孔,0.1 ng/ml,0.5 ng/ml,1 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,酶联免疫竞争法标准曲线,0.1,1,10,ng/ml,O.D.,9/11/2020