分子生物实验技术.ppt

1、分子生物实验技术原理,污染控制与资源化研究国家重点实验室 20120319,一、DNA提取原理和方法,核酸的理化性质 ：DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,DNA提取原理,天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。,步骤,1、细胞破碎 三种方法

2、机械方法：超声破碎法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：SDS处理； 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，使细胞壁破碎。,DNA提取的几种方法,(1) 浓盐法： A. 利用RNA和DNA在电解液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化钠溶液抽提,得到的DNP粘液与氯仿：异戊醇（24:1）一起振荡，使乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。 B. 用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。 A/B两种方法比较, B法使核酸降解可能少一些

3、。,C. 以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制样品中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用1.5M NaCl，0.015M柠檬酸钠（并称SSC溶液）提取DNA。,（2）阴离子去污剂法,用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA，由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。,（3）苯酚抽提法,苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的活性。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已

4、断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 。,（4）水抽提法,利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇。立即用搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以洗涤，最后在空气中干燥，即得DNA样品。此法提取的D

5、NA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。,环境样品常见的有水样、土壤、生物膜等 水样可以先用0.22um的微孔滤膜过滤，然后把微孔滤膜剪碎，用于提取DNA 土壤、垃圾、生物膜、活性污泥这些样品因为杂质较多，在提取时要考虑杂质的影响，可先预处理去除一部分干扰物质后再提取 具体方法很多：直接提取法、间接提取法,1、水样DNA提取,用0.22um微孔滤膜过滤水样，将滤膜放入离心管，加TE 充分震荡混匀，12000rpm收集菌体，再悬浮于1ml TE，加20ul 20mg/ml 溶菌酶，室温10min；加40ul蛋白酶K，37度1h，加1/3体积5M NaC

6、l，剧烈震荡混匀， 12000rpm 离心5min，上清液用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，上清液加0.6V异丙醇沉淀离心后70%乙醇洗涤沉淀，再溶于TE中，加1/10V 3M pH5.2 NaAc后，2.5V 无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤后溶于50ul TE中，测定A260/A280， A260/A230 确定DNA的纯度和浓度 A260/A280 : 是衡量蛋白质污染程度的指标，通常在1.7-1.8之间较好； A260/A230：衡量腐殖酸污染程度的指标，一般在1.7-2.0 之间较好。,常用试剂盒品牌,MP Bio公司Fast-Prep SPIN Kit（for soil）

7、Mo Bio公司ultra clean soil DNA kit power clean soil DNA kit Qiagen公司：QIAamp DNA Stool Mini Kit Omiga 公司 国产试剂盒 按试剂盒操作说明提取样品DNA，置-20保存备用,Fast-Prep SPIN Kit（for soil）操作说明,1、称量500mg土样（离心适量活性污泥）到一个Lysing Matrix E管中，冰上静置2min。 2、加978ul的sodium phosphate buffer 到样品管中 3、加122ulMT buffer (保持管中有250500ul剩余空间） 4、在振荡

8、器中充分振荡混匀 5、13000rpm离心10min 6、将上清液转入到一个新的无菌2ml离心管中，加250ul PPS(蛋白质沉淀剂），手动混合10次 7、13000rpm离心5min，将上清液转入到一个无菌15ml离心管中（可用10ml管代替） 8、摇匀Binding Matrix suspension，加1ml到15ml管的上清液中,9、振荡离心管2min使DNA充分结合，再静置3min来沉淀Si化合物 10、小心的弃去700ul的上清液 11、重新悬浮剩余的上清液中的混合液，吸取700ul混合液到SpinTM Filter中，13000rpm离心1min，倒空收集管，再将剩余的混合物加

9、入到SpinTM Filter中，如前操作 12、加入500ulSEWS-M,轻柔的悬浮管中的Si 化合物 13、13000rpm离心1min，倒空收集管（重复12、13步一次） 14、13000rpm离心2min，使收集柱干燥，并将其置于一个新的无菌离心管中 15、在室温下静置5min，空气干燥SpinTM Filter 16、小心的加入50100ul的DES（或ddH2O),使所有的Si化合物湿润，55温浴5min 17、13000rpm离心1min，弃去SpinTM Filter，液体保存备用,电泳检测,二、PCR扩增,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，

10、 PCR ）：是一项在体外、短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。,Kary B. Mullis,PCR技术的创建,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,94变性,

11、50-65退火,XX延伸,72,94,55,PCR循环,1、PCR技术的原理,PCR的原理：以单链DNA为模板、4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸。多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。,PCR的三个基本步骤,(1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解 链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(5060)下与模板上的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension): DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新

12、的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR原理 变性(denaturatation) 退火( annealing) 延伸(extension),2、PCR反应五要素,引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP, dGTP, dCTP, dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物

13、 各50200umol/L 引物 10100pmol/L 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 0.5 2.5U Mg2+ 1.5mmol/L 加灭菌的双或三蒸水至 100ul,1）引物,引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 每条引物浓度一般 10100pmol/L, 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,2）酶及其浓度,目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯

14、 基因工程酶：大肠菌合成 典型的 PCR反应约需酶量 0.5-2.5 U/50l 酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,3）dNTP 的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP溶液呈酸性， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解，保存不当易变性失活。 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度取决于扩增片段的长度，注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔） 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低,单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA

15、结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,4）模板,5） Mg2+浓度,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。 适宜浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,3、PCR反应条件的选择,PCR反应条件: 温度 时间 循环次数,1）温度与时间的设置：,设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法

16、，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸, 变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般9394lmin足以使模板DNA变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败, 退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素

17、变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想,引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的退火温度：,Tm值（融解温度）=4（G+C）2（A+T） 复性温度=Tm值-（510） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合 增加温度能提高

18、PCR反应的特异性;降低温度可增加反应的灵敏性。, 延伸温度与时间：,Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90时，DNA合成几乎不能进行 一般72 时，TaqDNA聚合酶每分钟可以合成1000bp左右, 延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓

19、度模板的扩增，延伸时间要稍长些,循环次数,循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 一般选在3040次之间 循环次数决定PCR扩增程度 循环次数的多少：主要取决于模板DNA的浓度 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,4、PCR技术的特点,1）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2）特异性强,引物,引物,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计的基本原则,引物长度：一般15-30bp，常用18-27bp，有效长度不能大于 38

20、bp 产物长度：一般100600bp，最长可达10KB 序列Tm值 ：一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游 引物的Tm值一致,一般不超过2度. G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60% 引物自身：引物间无3端互补、二聚体或发夹结构 引物 3端：最末及倒数第二个碱基要求严格配对 引物特异性：应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,PCR反应的特异性决定因素,引物与模板DNA特异正确的结合； 碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性,常用引物设计软件,Primer5 generunner DNA star Oligo,3）简便、快速,PCR

21、扩增法只需要数小时，就可以用电泳法检出基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。 4）对标本的纯度要求低 不需分离病毒、细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针； 基因组DNA结构功能的研究,PCR的类型,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行

22、扩增。,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,3）多重PCR（复合PCR）,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,标记引物,观察,PCR产物,5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）,锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作

23、PCR扩增,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,6）PCR固相分析法,检测探针信号,可用于基因芯片的制作,7）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。,操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试

24、剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物,A.阳性对照,B.阴性对照,C.原位检测mRNA表达,8）-,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,三、核酸凝胶电泳,核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中向正极动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作

25、为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动速率出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯下确定DNA在凝胶中的位置。,影响核酸电泳的因素：,1核酸的性质 2凝胶孔径的大小 3电场强度和电场方向 4电泳环境： 缓冲液的组成和离子强度,核酸电泳的指示剂 ：,核酸电泳常用的指示剂有两种： 溴酚蓝 二甲苯青 均带有负电荷，电泳方向与核酸相同，从而指示核酸的位置，其中溴酚蓝泳动速度较快，二甲苯青较慢。,常用核酸凝胶电泳,琼脂糖电泳 丙烯酰胺凝胶电泳：变性梯度凝胶电泳( denaturing

26、 gradient gel electrophoresis, DGGE),1、琼脂糖电泳,原理：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254365 nm紫外光照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA（此法可观察到凝胶中2 ng的DNA）。如有必要可从凝胶中回收DNA片段，用于分子克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶（浓度越大凝胶孔径越小），分离DNA的范围广，约200 bp50

27、 kb。,2、变性梯度凝胶电泳,变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。 该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。,双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。 DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把

28、同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。,原理,不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。 同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。 然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。,DNA片段在DGGE胶中的迁移行为,在DNA片段的一端加入一段富含GC的

29、DNA片段（一般30-50个碱基对），使DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE/TGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985).,GC夹子,当用DGGE技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用PCR扩增的16S rRNA产物来反映微生物群落结构组成。 通常根据16S rRNA基因（16S rDNA）中比较保守的碱基序列设计通用引物，用来扩增微生物群落基因组总DNA，扩增产物用于DGGE分析。 由于DGGE

30、一般只能分析500 bp 以下的DNA片断，所以一般选择扩增16S rRNA基因的V3区（Muyzer,1993），或V6-V8区（Zoetendal, 1998）。,DGGE的两种电泳形式,垂直电泳：确定变性剂梯度 水平电泳：对比分析不同样品的微生物差异,垂直电泳确定变性剂梯度,垂直胶,垂直电泳时，胶从左到右是变性梯度（如上），在胶的左边，变性剂浓度低，DNA片段是双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的右边，由于变性剂浓度高，DNA一进入胶立刻发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA片段有不同程度的解链。在变性剂浓度临界于DNA片段最低解链区域时，DNA的迁移率有急剧的变化。因此，

31、DNA片段在垂直胶电泳染色后呈S形曲线。,水平电泳时间,优化确定电泳所需的时间：一般采用时间间歇的方法，即每隔一小时加一次样品，从而使样品的电泳时间有个梯度，根据结果，确定最佳的电泳时间。,染色方法,溴化乙锭（ethidium bromide，EB） SYBR Green I SYBR Gold 银染法：单、双链均能染色，灵敏度最高，缺点是DNA不能用于后续分析,染色双链,DGGE的应用,环境样品（土壤、水、活性污泥等）中细菌、古细菌、真菌、真核微生物的多样性分析（无需培养，直接提取DNA扩增检测）； 动、植物体内外共生微生物的检测； 食品微生物的检测； 医学领域碱基突变的检测； 杂合子检测等

32、等。,微生物多样性分析实验流程,环境样品DNA的提取 PCR扩增 变性梯度凝胶电泳指纹图谱带型分析特征条带的克隆测序,DGGE技术的缺陷,1、DNA提取和纯化时会有偏差 2、PCR扩增过程会产生偏差 3、不同细菌的基因组大小和rDNA的拷贝数不同 4、DGGE一般只能分析500bp以下的DNA片段，因此得到的系统进化相关信息少 5、相同的样品，不同的电泳条件得到的图谱会有所差异 6、单一的DGGE条带可能含有不止一种DNA序列 7、PCR过程中产生的异源双链和单链DNA会对分析单一条带序列造成偏差,四、定量PCR,以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中

33、靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。,实时荧光定量PCR (Real time PCR),实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Bisystems公司推出。与常规PCR相比，它具有特异性更强，有效解决PCR产物污染，自动化程度高，同时对模板进行准确定量等待点；敏感性通常达100拷贝/ml，且线性范围宽；重复性好， Real time PCR的结果相当稳定，同一标本的荧光量虽然却相差甚大，但CT值相同，定量也即根据CT值来确定。 在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。,实时

34、荧光定量PCR原理,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 常规PCR:对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,三个概念,扩增曲线,荧光阈值（threshold ）,阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。 手动设

35、置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99,一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的10倍。,Ct值 （Cycle threshold）,Real Time PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。( C-代表Cycle，t-代表threshold）,Ct值的重现性,同一个样品重复96次PCR的扩增曲线,Ct值,Ct值的特点： 不同仪器、相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,定量原理,理想的PCR反应：

36、 X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,定量PCR 定量原理绝对定量,在PCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程。 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,Real Time PCR检测方法,荧光染料嵌合法(SYBR Green I、PicoGreen) 荧光探针法 TaqMan probe Cycling probe Molecular Beacon probe Hybridization probe Scorpion

37、s probe Amplifluor probe,荧光染料嵌合法（SYBR Green I）,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色光激发波长的染料。,SYBR Green I,荧光染料嵌合法(SYBR Green I)作用机理示意图,SYBR Green 法优缺点,TaqMan探针为一寡核苷酸， 5端标记一个报告荧光基团(Reporter)， 3端标记一个淬灭荧光基团(Quencher)。,TaqMan Probe法作用机理,5,3,TaqMan Probe 法作用机理示意图,Taq酶需要有 53外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan法优缺点,SYBR Green I法vs Probe法,SYBR Green I 法 优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异