rochetbil和dbil项目介绍.ppt

1、Roche TBIL和DBIL项目介绍TBIL和DBIL检测方法学比较,Denny Dong; Dec 07, 2012,主要内容,胆红素的代谢 胆红素的分类和临床应用 胆红素的检测方法 罗氏胆红素试剂盒特点 胆红素检测的标准化,胆红素是胆汁中的主要色素，呈橙黄色。 胆红素具有：脂溶性，难溶于水。 毒性作用 抗氧化（抑制亚油酸和磷脂的氧化） 胆色素代谢以胆红素代谢为中心。 肝脏在胆色素代谢中起着重要作用,反 映 肝 脏 的 分 泌 与 排 泄 功 能。,胆红素测定的作用,胆红素的来源,来源,其它铁卟啉化合物：肌红蛋白、过氧化物酶、过氧化氢酶、细胞色素等,血红蛋白（主要来源，约占80%）由衰老的

2、RBC破坏、释放出的Hb分解,胆红素的生成,部 位：肝、脾及骨髓等网状内皮细胞中,衰老红细胞,血红蛋白,珠蛋白,血红素,胆红素,胆绿素,NADPH+H+,(250300 mg/天),胆红素在血液中的运输,胆红素：脂溶性，难溶于水,增高胆红素的水溶性，有利于运输 限制胆红素通透细胞膜对组织造成毒性作用,血液：白蛋白,胆红素,白蛋白胆红素复合物 （可逆结合）,竞争结合剂： 如磺胺药，水杨酸，胆汁酸等,胆红素在肝中的转变,婴儿出生7周后，体内Y蛋白才会达成人水平,1. 摄取,白蛋白胆红素 复合物,血液,2. 转化 胆红素 + UDPGA 葡萄糖醛酸胆红素 (结合胆红素),葡萄糖醛酸基转移酶,（1）水

3、溶性增强，易从胆汁排出，也易透过肾小球从尿排出。 （2） 不易通过细胞膜和血脑屏障,胆红素在肝中的转变,胆红素在肠道中的变化,结合胆红素 胆红素 胆素原（无色） (中胆素原、粪胆素原、尿胆素原) 粪胆素 尿胆素,葡萄糖醛酸基,胆素,肠道细菌,非结合胆红素,胆红素在体内的代谢,胆汁,胆色素代谢总结,主要内容,胆红素的代谢 胆红素的分类和临床应用 胆红素的检测方法 罗氏胆红素试剂盒特点 胆红素检测的标准化,胆红素的分类,（1）未结合胆红素(Bu)：未与葡萄糖醛酸基结合，具亲脂性，须加入加速剂破坏分子内部的氢键后才能与重氮试剂反应，又称间接胆红素。占总胆红素的4/5。 （2）结合胆红素(Bc) ：与

4、葡萄糖醛酸基结合，具亲水性，与重氮试剂直接反应，又称直接胆红素(DBIL)。占总胆红素的1/5。,非结合胆红素的结构（ ,Bu）,血红蛋白的降解产物 在血液中和白蛋白以非共价键的方式结合 在肝脏被清除 折叠的结构，几乎不溶于水。 不能直接参与重氮反应 是新生儿生理性黄疸的最好指标,结合胆红素(和;Bc),在肝细胞内由非结合胆红素转化而来 在肝脏的酶作用，生成了单葡萄糖醛酸酯胆红素和双葡萄糖醛酸酯胆红素 造成胆红素分子内各基团间原有距离增大，难以再形成氢键，由此，使胆红素的亲水基团暴露在外，表现出水溶性，便于从胆管排入肠道。 是胆道梗阻解除后最敏感的指标 可直接参与重氮反应，表现为直接反应的胆红

5、素。,血清胆红素与黄疸,正常血清 未结合胆红素:占4/5（有毒） 总胆红素 17.1umol/L 结合胆红素：占1/5（无毒）,34.2 umol/L 巩膜、皮肤、 黄疸 粘膜黄染 (显性） 17.1- 34.2 umol/L 无黄染 隐性黄疸,黄疸的种类(按血清胆红素的来源)： 溶血性黄疸 又称肝前性黄疸。 胆红素的来源肝脏的转化能力 游离胆红素过多 肝细胞性黄疸 又称肝原性黄疸。 肝脏转化能力降低 游离和结合胆红素均升高 阻塞性黄疸 又称肝后性黄疸。 结合胆红素排泄障碍 结合胆红素过多,黄疸是指高胆红素血症引起皮肤、巩膜和粘膜等组织黄染的现象。,黄疸的鉴别诊断,胆红素检测的临床意义,（1）

6、黄疸及鉴别 DBi/TB 比值 60% 阻塞性黄疸 （2）肝细胞损害程度和预后的判断。 （3）新生儿黄疸病情掌握。 （4）再障等疾病，TB减少。,胆红素的异常代谢,黄疸 1、胆红素（橙黄色）+弹性蛋白 组织黄染 巩膜、皮肤、黏膜 2、根据血浆胆红素浓度，黄疸程度： 隐性黄疸（1.02.0mg/dl） 显性黄疸（ 2.0mg/dl）,黄疸的发生机制,非结合胆红素增高 溶血性黄疸 新生儿黄疸,结合胆红素增高 结合后转运障碍： Dubin-Johnson 综合症 胆道梗阻: 胆结石,结合障碍 - 生理性黄疸 - Crigler- Najjar 综合症,摄取减少 :Gilbert综合症,血浆,肝细胞,

7、Bile canaliculi,A,Bu,A,Bu,A,di G,Bc,G,Bc,di G,Bc,葡萄糖醛酸转移酶,A,Bu,A,A,Bu,溶血性黄疸（肝前性黄疸）,溶血血浆游离胆红素 肝脏中结合胆红素肠道中胆素原重吸收尿胆素原尿胆素 但是，血浆结合胆红素不变，尿胆红素阴性,溶血血浆游离胆红素 肝脏中结合胆红素肠道中胆素原重吸收 尿胆素原尿胆素 但是，血浆结合胆红素不变，尿胆红素阴性。,结合胆红素,肝细胞性黄疸（肝原性黄疸）,肝脏对胆红素的摄取、转化障碍血浆游离胆红素 肝内毛细胆管破裂，结合胆红素返流入血血浆结合胆红素尿胆红素阳性 尿胆素原、尿胆素 不确定,肝脏对胆红素的摄取、转化障碍血浆游离

8、胆红素；同时： 肝内毛细胆管破裂，结合胆红素返流入血血浆结合胆红素尿胆红素阳性 重氮试剂间接、直接反应双阳性；尿胆素原、尿胆素 不确定,阻塞性黄疸（肝后性黄疸）,胆管阻塞破裂血浆结合胆红素尿胆红素阳性 肠道中胆素原生成、重吸收减少尿胆素原、尿胆素 游离胆红素不变；尿三胆,1、胆管阻塞破裂血浆结合胆红素尿胆红素阳性 2、肠道中胆素原生成、重吸收减少尿胆素原、尿胆素 3、重氮试剂间接、直接反应双阳性；游离胆红素不变,三种黄疸的临床检验特征,新生儿生理性黄疸,新生儿血液内原来过多的红细胞被破坏，未结合胆红素生成过多。 婴儿出生7周后，体内Y蛋白才会达成人水平，肝细胞内载体蛋白Y蛋白少，肝细胞摄取未结

9、合胆红素的能力不足。 肝细胞内胆红素葡萄糖醛酸基转移酶生成不足，结合胆红素生成少。 肝细胞胆汁分泌器发育不完善，对肝胆汁分泌的潜力不大。 母乳中含有孕二醇，对葡萄糖醛酸基转移酶有抑制作用。,过多的游离胆红素可与脑部基底核的脂类结合，并干扰脑的正常功能，称胆红素脑病或核黄疸。,如：新生儿黄疸/高胆红素血症,反相HPLC (A436 nm)分离法,时间 (min),:Bu 未结合胆红素,:mBc 单葡萄糖醛酸结合胆红素,:Bd 与白蛋白共价结合的胆红素,Kuenzle CC, et al.: 四种血清胆红素及三种胆汁胆红素的分离和定量检测。J Lab Clin Med 1966; 67:282 L

10、auff JJ, et al.: 血清和胆汁胆红素反相HPLC分离法。 J Chromatogr 1981; 226:391,:dBc 双葡萄糖醛酸结合胆红素,胆红素的四种成分,在血液循环中结合胆红素和白蛋白形成的。 白蛋白缓慢地非酶作用置换了原葡萄糖醛酸酯。类似于糖化血红蛋白。 在长期的高结合胆红素血症患者的血液内，才能被检测出来。 在血液循环中的清除缓慢。半衰期2-3周。 因为胆红素不存在氢键的影响，所以胆红素可以与重氮直接胆红素反应。 B不能通过肾小球故不从尿排出。 B只存在于人血清而不存在于胆汁，说明它不从胆汁排出，即它的代谢调节不依赖肝胆的排泄功能,胆红素,B的代谢及其在疾病时表现与

11、其它三种组份有重要差别。 正常人血清中没有B。 新生儿黄疸：以Bu为主黄疽。 体质性肝功能不良性黄疸：(Gilberts综合症,葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)不足引起）B占TBIL50%。 认为B源于Bc。它的形成与肝的结合，与肝功能的成熟有关。,胆红素,Me,R,COOR2,CH2,CH2,Me,Me,Me,R,N H,CH,O,N H,CH,N H,N H,O,CH2,COOR1,CH2,CH2,mBc = R1 = glucuronic acid and R2 = H (monoglucuronide) dBc = R1 and R2 = glucuronic acid (diclucur

12、onide),结合胆红素的结构,Me,R,COOH,CH2,CH2,Me,Me,Me,R,N H,CH,O,N H,CH,N H,N H,O,CH2,非结合胆红素的结构,Me,R,COO,CH2,CH2,Me,Me,Me,R,N H,CH,O,N H,CH,N H,N H,O,CH2,COO,CH2,CH2,胆红素: R1 或 R2 = 白蛋白 共价键结合白蛋白,白蛋白,胆红素结构,主要内容,胆红素的代谢 胆红素的分类和临床应用 胆红素的检测方法 罗氏胆红素试剂盒特点 胆红素检测的标准化,胆红素检测的常用方法分类,1.重氮盐法diazo reaction 原理：橙黄色的胆红素与重氮盐反应生成有

13、色的偶氮胆红素 （偶氮胆红素在酸性PH值为红色，碱性PH值为蓝色） 一般在酸性环境下，主波长546nm，次波长800nm 2.氧化法-oxidative methods 原理：橙黄色的胆红素被氧化成绿色的胆绿素 450nm主波长，546nm次波长 3.直接分光光度法（Direct Spectrophotometry） 原理：直接检测胆红素的颜色，波长460nm （血清指数） 4.高压液相色谱（HPLC） 5.经皮直接测量（transcutaneous methods）,胆红素常用生化检测方 法,重氮盐法diazo reaction 2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法（DPD法） 改良Malloy-

14、Evelyn法 Jendrassik-GrOf 法 改良JG法 改良间氨基苯磺酸法 强生干片法 氧化法oxidative（enzymatic29 Suppl 126:Abstract 11.12.,主波长：570nm 吸收峰：紫色,Roche BIL-T (ACN101)总胆红素试剂， 抗干扰：H75，L50,改良Malloy-Evelyn重氮法,Malloy HT, Evelyn KA. The determination of bilirubin with the photoelectric colorimeter. J Biol Chem 1937;119:481-490,Wahlefe

15、ld AW, Herz G, Bernt E. Modification of the Malloy-Evelyn method for a simple, reliable determination of total bilirubin in serum. Scand J Clin Lab Invest 1972;29 Supplement 126: Abstract 11.12.,重氮盐： 氨基磺酸和重氮基离子， 醋酸钠，HCL，表面活性剂,主波长：550nm 吸收峰：紫红色,1972 Wahlefeld AW,试剂稳定性好，抗溶血及脂血的干扰性好。,Roche TBILI(ACN294

16、) 总胆红素试剂 抗干扰:H1000，L0100,J-G法,Jendrassik297:81-89.,改良J-G法（IFCC参考方法）,改良J-G 法2004年确认为参考方法，其灵敏度、准确度和特异性均较高，但显色时间相对较长。,Jendrassik29:31-36.,改良间氨基苯磺酸重氮法,重氮盐： 3,5间氨基苯磺酸 磷酸，HEDTA，NaCl,Roche BILD2(ACN734)总胆红素试剂， 抗干扰:H25，L750,Roche 于2012年上市,试剂开瓶稳定期为6周，加强了胆红素的检测，抗干扰能力得到了提升。,主波长：546nm 吸收峰：紫红色,改良间氨基苯磺酸重氮法vs改良JG法

17、,重氮盐：3,5间氨基苯磺酸2,5对氨基苯磺酸,缓冲体系：磷酸，HEDTA，NaCl（PH1.9） HCL，亚硝酸钠，碳酸氢钠（ PH1.2）,主要特点。 缓冲体系的PH值略有升高，减少了胆红素的自然氧化。 更新缓冲体系，减少与白蛋白结合的游离胆红素溶解在反应体系中。 重氮盐由对位改为间位，让重氮反应更加平稳。提高了胆红素的结合能力。,-优势 试剂开盖上机稳定性总体增加，可达6 周。 抗溶血和脂血干扰能力得到了提升。 肝素干扰不会导致假性偏的检测。低的测试结果，适用于新生儿样本。 准确度增加，可最大程度避免“直接胆红素浓度总胆红素浓度”的矛盾检测结果。 均为即用型试剂盒，不需要手工制备。,改良

18、间氨基苯磺酸重氮法,二甲亚砜（DMSO）法,DMSO 法的最大优点为反应时间短，呈色后稳定性极佳（可稳定近2 小时） 对脂血抗干扰性较强，受溶血干扰较轻 血红蛋白3.5g/L 时依然有较大的干扰 只能测定总胆红素,胆红素氧化酶（BOD）法,胆红素氧化酶（BOD）在碱性环境中可氧化所有胆红素成分，包括大部分（85%）的B ，这一特性可用于总胆红素测定。 在酸性条件下，mBc、dBc 和大部分B 均被氧化，只有Bu 不被氧化，这一特性可用于Bc（结合胆红素或直接胆红素）的测定。 可根据不同胆红素反应的最适pH 差别，可分别定量测定总/直胆。 特异性强、灵敏度高、重复性好，对溶血、脂血等抗干扰性强，

19、操作简单，适用于自动化测定等。但该法所涉及的工具酶价格昂贵，故商品试剂价格昂贵。 胆红素氧化酶容易受到血清蛋白，尤其是白蛋白的影响，这主要由于作为底物的胆红素在掺入血清白蛋白的 螺旋链时，底物便不能接近酶分子中的活性中心（这一现象称为立体障碍）。 与血清白蛋白结合的 胆红素在保持白蛋白 螺旋链的pH 范围内对胆红素氧化酶的作用有抵抗性。,氧化酶法特异性较好，但酶的来源、纯度、稳定性等问题，目前较少使用,钒酸盐法,1993 年日本和光开发出商品钒酸盐胆红素氧化法试剂。,缺点：与d胆红素的反应不充分，血清中胆绿素也会干扰到胆红素的检测，直接胆红素，溶血对测定值会有负误差。钒酸盐环保问题。,Doum

20、as BT, Yein F, Perry B, et al: Determination of the sum of bilirubin sugar conjugates in plasma by bilirubin oxidase. Clin Chem 45:1255- 1260, 1999,Tbil检测PH8，主波长450nm，吸收峰：黄色 DBIL检测PH4，主波长450nm，吸收峰：黄色 PH10时，选择性氧化双葡萄糖醛酸脂和5%的的非结合胆红素，但不包含d胆红素，血清中胆绿素也会干扰到胆红素的检测。,优点：试剂稳定性好，抗干扰能力强。,BILD2vsDBIL1vsWako钒酸法,强生

21、Vitros 干片法胆红素检测,2种干片（TBil/Bubc）， 2 种方法学（重氮法/光谱法） TBIL 干片：重氮反应 以J-G方法为参考方法 使用540 nm和 460 nm波长 BuBc干片：胆红素组分-分光光度法 以HPLC方法参考方法 使用400 nm和 460 nm波长, TBIL = Bu + mBc + dBc + Bdelta ,TBIL干片检测胆红素的全部组分,Vitros 胆红素的分析方法Tbil,干片地城, BuBc = Bu + mBc + dBc,检测的BU,检测的BC,Vitros 胆红素的分析方法BuBc,通过酶染剂增强游离胆红素的反射光强度。通过不同的反射光

22、谱测量，一张干片同时检测Bu和Bc。 由于胆红素分于体积较大而被阻止在扩散层而无法到达反射层。所 BUBC干片不直接测定胆红素。 胆红素TBIIBUBC胆红素,主要内容,胆红素的代谢 胆红素的分类和临床应用 胆红素的检测方法 罗氏胆红素试剂盒特点 胆红素检测的标准化,12144336216 P模块小包装12144492216 /12144506216 D模块大包装BIL-T ACN101DPD重氮法,检测原理 在洗涤剂作用下释放出间接胆红素。随后总胆红素在强酸性条件下（pH值12）与2,5-二氯苯基重氮盐耦合形成偶氮胆红素。 胆红素 + 重氮离子 偶氮胆红素 形成的红色偶氮染料的色强度与总胆红

23、素浓度成正比，光度计测定。 试剂-工作溶液 R1 表面活性剂；盐酸：100 mmol/L R2，R2a 表面活性剂；盐酸：100 mmol/L；2,5-二氯苯基重氮盐：3.0 mmol/L 稳定性： R1：即用型42天 R2 ：配制好后14天,11822713190 P模块小包装11877941190 /11877950190 DP大包装TBILI ACN 018改良Malloy-Evelyn重氮法,检测原理 在加入适合的增溶剂后，总胆红素与酸性介质中的重氮离子相结合。 胆红素 + 重氮离子 偶氮胆红素 生成的偶氮胆红素颜色强度与总胆红素浓度成比例，光度计测定。 试剂-工作溶液 R1C2H3N

24、aO2（乙酸钠缓冲液）：85 mmol/L；H3NO3S （氨基磺酸）：110 mmol/L；表面活性剂；增溶剂 R2 HCl：100 mmol/L；重氮离子：3 mmol/L 稳定性： R1：即用型35天 R2 ：即用型35天,11555413 216 P模块小包装BIL-D ACN294JG法,检测原理 重氮化对氨基苯磺酸（对氨基苯磺酸与酸化亚硝酸钠反应产生）与胆红素反应形成偶氮胆红素。在直接胆红素检测中，仅有结合胆红素与重氮化对氨基苯磺酸反应。 胆红素+重盐离子 偶氮胆红素 所形成的红色偶氮染料的颜色强度与直接（结合）胆红素浓度成正比，可采用光度计进行测量。 试剂-工作溶液 R1EDTA

25、：1.5 mmol/L；NaCl：152.5 mmol/L。 R22,5二氨基苯磺酸（对氨基苯磺酸）：29 mmol/L；盐酸：170 mmol/L R2a亚硝酸钠：25 mmol/L. 稳定性： R1：即用型6周 R2 ：配制后7天,11986660 018/11986651 018 因子法大包装DBILI 大包装 ACN659改良JG法,比色法 样本加入R1， 加入 R2 并开始反应：重氮化对氨基苯磺酸（对氨基苯磺酸与酸化亚硝酸钠反应产生）与胆红素反应形成偶氮胆红素。在直接胆红素检测中，仅有结合胆红素与重氮化对氨基苯磺酸反应。 胆红素+重盐离子 偶氮胆红素 所形成的红色偶氮染料的颜色强度与

26、直接（结合）胆红素浓度成正比，可采用光度计进行测量。 试剂-工作溶液 R1盐酸：50mmol/L R2对氨基苯磺酸：25.7 mmol/L；盐酸70 mmol/L,亚硝酸钠：2.7 mmol/L，碳酸氢钠13.9mmol/L 稳定性：R1 ：即用型至有效期，R2:配制后14天 因子法：使用mg/dL单位 保留两位小数 K因子=2510 理论因子：使用umol/L单位，保留一位小数 2510X17.1/10= 4292.1 ，经验设置成5500,05589037 190新一代直胆试剂盒BILD2 ACN 734改良间氨基苯磺酸法,检测原理 重氮化间氨基苯磺酸（间氨基苯磺酸与酸化亚硝酸钠反应产生）

27、与胆红素反应形成偶氮胆红素。在直接胆红素检测中，仅有结合胆红素与重氮化对氨基苯磺酸反应。 胆红素+重盐离子 偶氮胆红素 所形成的红色偶氮染料的颜色强度与直接（结合）胆红素浓度成正比，可采用光度计进行测量。 试剂-工作溶液 R1磷酸：85mmol/L，HEDTA: 4.0 mmol/L，NaCl: 50 mmol/L;表面活性剂pH 1.9 R23.5间氨基苯磺酸：1.5 mmol/L；pH 1.3 稳定性 ：R1:即用型6周，R2即用型：6周,物质对光的选择性吸收吸收互补光,溶液之所以呈现不同的颜色，是与它对光的选择性吸收有关。当一束白光（由各种波长的色光按一定比例组成）通过一有色溶液时，某些波长的光被溶液吸收。另一些波长的光不被吸收而透过溶液。 溶液的颜色由透过光波长所决定。如CuSO4溶液强烈地吸收黄色的光，所以溶液呈现蓝色。 如溶液对白光中各种颜色的光都不吸收，则溶液为透明无色，反之，则呈黑色。 如果两种颜色的光按适当的强度比例混合后组成白光，则这