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文档简介

1、PCR反应原理及其操作,1.PCR的基本原理 2.PCR反应体系 3.PCR的基本步骤,PCR的基本原理,试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链， 单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。,PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200umol/L （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L,PCR的基本步骤,1. D

2、NA变性 （90-96）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。2. 退火（复性）（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3. 延伸（70-75）：在Taq酶（在72左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。,高温变性,低温退火,中温延伸,在引物作用下，Taq酶从引物3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5端自3端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链。,PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。 此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。,理论扩增率：2n递增（n为循环次数），2530循环，目标DNA可增加109倍。 由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为

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