高中生物 第四章 生物化学与分子生物学技术实践 4.2 分子生物学技术二教案（选修1）

1、第二节 分子生物学技术 pcr技术教学目标：1、知识与技能：1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用2、过程与方法：在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件3、情感态度价值观：通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作教学难点：PCR的原理教学方法：启发式教学教具使用：多媒体课件共案部分个案部分教学过程教师主导活动学生主体活动课前：完成本章知识的梳理，及导学案中的自检题。检查汇总。学生完成本章知识的梳理，做导学案中的自检题。课中：对上节课存在问题

2、进行点拨。新授：根据学生自学情况，引导学生分析主要的问题。强调以下几点。1PCR技术的原理是什么?2进行PCR扩增时，向离心管中加入的是什么物质? 3简述PCR扩增的过程。4为什么在聚合酶链式反应中要使用DNA聚合酶?5简述“目的DNA片段的体外扩增”的过程。疑难解析 1PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93C左右一定时问后，使模板DNA 链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)

3、：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性退火延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。 3引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA

4、 NI补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。学生对上节存在问题进行讨论。学生自学基础知识。 学生根据导学案内容讨论并展示个人、小组成果。思考：课后：布置课外作业及下一节预习提纲。（见导学案）学生完成课外作业及下一节预习。板书设计多聚酶链式反应扩增DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性复性延伸操作步骤配制PCR反应体系移入离心管放入PCR设置工作参数DNA扩增测定含量稀释调零测定并读数计算教学札记三、其他补充教学资料（各位教师根据各班教学特点选择补

5、充资料，可另附纸）1基础知识PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：11细胞内DNA复制条件分析：条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶DNA聚合酶打开DNA双螺旋催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点12细胞内DNA复制过程（1）DNA结构： 核苷酸分子的结构与方向性： 由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链： DNA双螺旋结构的反向平行结构：（2）DNA的复制过程:解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。引物结合：在DNA单链3端与DNA

6、反向配对结合，确保引物3端与DNA单链准确配对。DNA聚合酶结合：子链合成：DNA聚合酶从引物3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“53合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被

7、DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。思考DNA分子能准确复制的原因有哪些？DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。思考细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。13DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80100时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。思考缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4PCR的反应过程延伸复性变性变性：在95时DNA解旋复性：在50时

8、引物与DNA单链结合延伸：在72时合成DNA子链（两个引物间的序列）2实验操作21 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水22 实验操作步骤23 按照PCR反应体系配方配制反应液；（2）将PCR反应体系50L用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；（3）将微量离心管放到PCR仪中；（4）设置PCR仪的工作参数。（5）DNA在PCR仪中大量扩增。24 水浴法：将微型离心管依次在95、55、72的恒温水浴锅中循环处理相应时间。3实验注意事项31避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。32缓冲液和酶分装成小份，20低

9、温保存。33每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。34混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。4结果分析与评价41反应液稀释：取2LPCR反应液，添加98L蒸馏水；2分光光度计调零：将100L蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。42将100L反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。43计算：DNA含量50光吸收值稀释倍数高二生物PCR技术的原理和扩增的过程导学案 使用时间： 编制人： 一、学习目标掌握PCR技术的原理和扩增的过程。二、知识构成：1细胞内DNA复制条件分析：条件组分作用模板原料酶能量引物2、DNA结构： 核苷酸分子的结构与方向性： 由

10、核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链： DNA双螺旋结构的反向平行结构：3、DNA的复制过程:解 旋： 酶、 打开，形成两条 单链。DNA聚合酶结合：子链合成：DNA聚合酶从引物3端开始，将配对的 连接起来。思考DNA分子能准确复制的原因有哪些？ 思考细胞内哪些物质是从头合成的？ 4、PCR是指 。5、我国自1986年提出“ ”计划至今，在生物 技术方面已取得了一系列突破性的进展，许多成 果已转化为生产力。其成果主要表现在 、 、 等方面。6、1985年，美国科学家等人成功的建立了在体外 的实验技术，被称为 ，简称 。7、PCR体外扩增DNA的过程类似生物体内的 DNA复制的过程，两

11、者都需要 、 、 、 ( 、 、 、 )，都需要 和 ，所不同的是 。8、PCR对DNA的扩增具有 、 和 等特点。9、进行PCR扩增时向离心管中加入的物质包括： 、 、 、 、 、 。 10、PCR扩增是在 中进行的，具体过程包括： 、 和 。此三步骤所需的温度分别是 、 、 。11、运用PCR技术扩增DNA的过程中，变性的目的是 ；退火的目的是 ；延 伸的目的是 。12、体外扩增DNA片段的反应程序是： 、 、 (以上过程循环 次)一 。三、学法和自检：需要DNA连接酶参与的过程有 ( ) ADNA复制 BDNA体外重组 CDNA损伤的切除修复 DRNA逆转录 课题 PCR技术的原理和扩增

12、的过程 四、达标检测1DNA分子在复制时要先解旋，这时下列哪一对碱 基将从氢键连接处断开 ( ) A腺嘌呤与尿嘧啶 B腺嘌呤与胸腺嘧啶 C鸟嘌呤与胸腺嘧啶 D腺瞟岭与胞嘧啶 2如果用重氢标记一个DNA分子，然后把这个DNA 进行扩增，扩增时所用的原料不含重氢，经10次复制后，含重氢标记的DNA数量将为 ( ) A1个 B2个 C1022个 D(1022)一1个3实验室内模拟生物体DNA复制所必须的条件是 下列的哪几个 ( ) 酶游离的脱氧核苷酸 ATP DNA 分子mRNAtRNA适宜的温度 适宜的酸碱度 A B C D4(多选)PCR对DNA的扩增的特点是 ( ) A快速 B简便 C专一性

13、D零错误5以RNA为模板，按照RNA中核苷酸顺序合成 DNA(称逆转录)，此过程中需要的酶是 ( ) ADNA指导的DNA聚合酶 BRNA指导的RNA聚合酶 CRNA指导的DNA聚合酶 DDNA指导的RNA聚合酶6参与DNA复制的几种酶的作用次序是 ( ) ADNA解链酶一引发酶一DNA聚合酶一DNA连接酶一切除引物的酶 BDNA解链酶一引发酶一DNA聚合酶一切除引物的酶一DNA连接酶 C引发酶一DNA解链酶一DNA聚合酶一DNA连接酶一切除引物的酶 DDNA解链酶一引发酶一切除引物的酶一DNA连接酶一DNA聚合酶五、学习小结和课外作业：1、学习小结：2、上本作业：3、课本或资料选题：4、补充练习： PCR技术是把某一DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异的扩增任何要求的目的或DNA分子片段；电泳技术则是在外电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术，利用它可分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质和作亲子法学鉴定。下图是电泳装置及相应电泳结果。请回答： (1)电泳与叶绿体色素分离采用的纸层析法比较，后者使用的介质是 。电泳过程中分子的迁移速率除与本身所带净电荷的多少有关外