第七章花药培养和花粉培养.ppt

1、第七章,花药培养和花粉培养,主要内容,花粉和花药培养技术 花粉和花药培养应用,(1) 掌握花药培养和花粉培养的区别 (2) 了解花药最佳接种时期 (3) 掌握花药培养的大致过程 (4) 掌握花粉发育的四种途径 (5) 掌握花粉培养的大致过程,教学目的与要求,胚珠,花的结构,花药是花的雄性器官，花药培养属器官培养； 花粉是单倍体细胞，花粉培养与单细胞培养相似 花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍体植株。 单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株，这样可缩短育种周期，获得纯系。花培已成为植物育种的一种重要手段。,一、概述,植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数目只有体

2、细胞的一半，叫做单倍体细胞(haploid cell)。 花粉和花药的培养(pollen and anther culture)是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株，叫做单倍体植物(haplobiont)。,一、概述,花药培养 是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。,花粉和花药培养的研究意义,诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期 有利于筛选隐性突变体，提高选择效率 获得无病毒个体 有利于隐性基因控制性状的选择 快速获得

3、自交系的超雄株,单倍体植株育种,花药培养简史,1964年：印度学者古哈(Guha)和马斯瓦瑞 （Maheswari ）将南洋金花花药培养发育成胚 1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花药培养获得烟草植株 1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株 目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株,花药培养的主要目的，是培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源。 利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。 构

4、建永久性分离群体双单倍体系（Doubled haploid)，用于基因定位。 双单倍体：是指单倍体细胞（花粉或卵细胞）经过人工或自发加倍后得到双单倍体细胞，细胞经诱导分化可发育为单双倍体植株。,花药培养与单倍体育种,大大缩短育种周期,通过多次自交或近交获得的几乎是同质结合的品系,单倍体植株再通过某种手段使染色体组加倍（如秋水仙素处理）从而使植物恢复正常染色体数,确定取材时间 选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。 在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，在外部

5、形态上可根据叶枕距为515cm，颖片（禾本科植物小穗基部，由苞片转变而成）淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件来判断。,二、花药培养技术,水稻花药培养,旗叶鞘用70酒精擦洗一遍,剥去旗叶鞘，取出稻穗,左手持穗，右手用镊子取出花药，无菌培养皿中,70酒精，洗2遍,用接种环接种到培养基上,培养5天后，花药变黑褐色，20天花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先形成芽，后长出根，形成幼苗。,选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。 操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。,注意事项,光照(1218h，5

6、,00010,000 lx，28) 黑暗(12-16h，22)周期交替进行。,花药培养的条件,花粉发育时期是影响培养效果的重要因素 在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多数植物来说，单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。 如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大麦)或单核中期(玉米、小麦)反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。,1、影响花药诱导频率的因素, 花药供体植株的生长条件对花药培养反应的影响很大 例如：水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花药愈伤组织的

7、诱导率明显地提高，同步化程度高。, 培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件 我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。 N6培养基的特点是铵离子浓度较低。 随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物素，研制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦的花药出愈率。 以马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广泛地应用于小麦花药培养，效果良好。,培养基中的植物生长物质的种类会影响花粉发育的途径,一般在禾本科植物中，常用15mg/L 2,4-D或NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移至降低或去除生长素或补

8、加细胞分裂素类物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。,培养基中糖的种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响,朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21 mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导频率可增加210倍。 一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对花粉的生长无妨碍。 最适蔗糖浓度： 烟草的为3 水稻为36 玉米则为1215,在培养基中加入活性炭能促进花药培养,水稻的柱头-花药,以15预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的产量。 例如，在4下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。

9、 各种植物要求预处理的温度和时间不同。,2、 低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率,小麦要求先高温培养64天之后，再转入2830下培养。一直高温培养效果并不好。 较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一个有效措施。,培养温度是影响花药反应的一个重要因素,3、花药培养过程,花药材料的选取 关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。 大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。,黄心乌花药培养,甜椒花药培养,草莓,花药愈伤组织,再生植株

10、,花药植株,杜兰小麦的花药培养,A 花药在BAD-3诱导下，3周后形成胚状体和愈伤组织 B 另一个花药在BAC-1培养基中已愈伤组织中长出叶片 C 更多的花药在BAD-3培养基上诱导出愈伤组织与子叶 D 从BAC-1转移到BAD-1分化培养基中形成的愈伤组织 E 在MS培养基中培养5-6周，愈伤组织开始分化根和绿色的新芽 F 在MS培养基中培养7-8周，可形成大量的根和幼茎 G 在MS再生培养基中培养8周后，可由最初的花药形成小植株 H 由花药形成的健壮小植株 I 花药形成的植株在同样的MS再生培养基中生长，可因培养条件改变而形成不正常的植株,花粉植株染色体可自发加倍 人工措施染色体加倍 传统

11、方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋水仙素溶液处理单倍体植株，时间为2496 h。 浸泡试管苗方法 处理芽方法 浸根方法,单倍体植株的二倍化,花药培养脱毒,1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒； 花药采取时期单核期：花蕾4-6mm，花药1mm 花药诱导愈伤组织培养基 MS + IAA4mg/L + BA2mg/L + KT2mg/L +蔗糖30g+琼脂7g/L 增殖培养基MS + GA1mg/L+ IBA0.2mg/L + BA1mg/L+ 蔗糖30g + 琼脂7g/L 生根培养基1/2MS + IBA0.2mg/L + 活性炭3g/L + 蔗糖20g + 琼脂7g/L,毛曼陀罗花药培养，并

12、诱发再生植株,三、花粉培养,花粉培养成苗途径与花药培养比较: 相同点： 胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径 不同点： 花粉培养： 需进行花粉的分离 特殊的花粉诱导培养,一、花粉培养的操作过程,选幼年玉兰树花蕾,取下花蕾（镜检）,预培养数天,取花药,接种,分离 花粉,药壁向花粉提供营养物质 通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质,过滤离心,再生,低温预处理,消毒,二、培养基,1. 基本培养基,2. 激素种类和浓度,3. 蔗糖浓度,1、基本培养基,MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养 B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养 N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养,细胞分裂素可促进胚状体形成

13、 生长素可诱导愈伤组织形成 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗,2、激素种类和浓度,较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织 较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗,3、蔗糖浓度,三、单倍体植株染色体加倍的方法,单倍体植物天然发生的途径：,孤雌生殖,无配子生殖,孤雄生殖,也称单性生殖，即卵不经过受精也能发育成正常的新个体，如黄瓜,是指配子体可以不经过配子的结合而直接产生孢子体的，如蕨类植物,是指由雄性配子直接进行胚胎发育成新个体。通常由杂交或实验处理后获得的，自然界中很少发生,单倍体植株染色体加倍的方法,1、自然加倍 2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的