生物化学课件：第10章复制(人卫7改)

1、第三篇基因信息的传递,蛋白质,遗传信息传递的中心法则 （central dogma）,Francis Crick (1916-2004 ),DNA,RNA,复 制,主要内容 DNA的生物合成 复制 RNA的生物合成 转录 蛋白质的生物合成 翻译 基因表达调控 基因重组与基因工程,DNA的生物合成 (复制) DNA Biosynthesis，Replication,第 十 章,复制(replication) 以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,亲代DNA,复制,子代DNA,本章主要内容： 复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程 逆转录和其他复制方式 DNA损伤(突变)与修

2、复,复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication,第一节,半保留复制 双向复制 方向性 半不连续复制 高保真性,DNA复制的特点,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T

3、 A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目 录,一、半保留复制的实验依据和意义,子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全为新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,复制几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性(保真性)

4、 。,二、双向复制,从起始点(origin)开始向两个方向解链，形成两个方向相反的复制叉，称为双向复制。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。 复制子是独立完成复制的功能单位。 高等生物有数以万计的复制子，长度差异很大。,真核生物的多复制子复制,复 制 进 程,真核生物的多复制子复制电镜图,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的双向复制。,领头链 (leading strand),随从链 (lagging strand),三、DNA的半不连续复制,冈崎片段,子链沿母链模板复制，只能从5向3延伸。 同一个

5、复制叉上只能有一个解链方向。,DNA的半不连续复制,复制的方向与解链方向相同，复制是连续进行的，这条子链称为领头链（前导链）。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，这条不连续复制的子链称为随从链（后随链）。 随从链中的不连续片段称为冈崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication,第二节,dNTP 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol 解开成单链的DNA母链 短链RNA，提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合,底物:,聚合酶:,模板:,引物

6、:,其他的酶和蛋白质因子,参与DNA复制的物质,（N=A、T、G、C）,聚合反应的特点：,需要引物和模板； 新链的延长5 3方向,复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase DDDP ) (DNA-directed DNA polymerase DDDP ) 缩写：DNA-pol 、DDDP,活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,二、DNA聚合酶,1959 年获诺贝尔生理学或医学奖,奥乔亚 科恩伯格 Severo Ochoa Arthur Kornberg

7、,核酸外切酶活性,3 5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 （校读）,5 3 外切酶活性能切除突变的 DNA片段， 切除RNA引物。,合成中的DNA分子,3 5 5 3 外切酶 聚合酶,N,C,5 3 外切酶,小片段,大片段（ klenow片段）,切除RNA引物 损伤修复,校读功能,（常用的工具酶）,聚合功能,DNA-pol （109kD）,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),7-10个亚基组成的不对称二聚体,核心酶（222

8、） 亚基催化磷酸二酯键的形成。 亚基具有35核酸外切酶 活性及碱基选择功能,滑动夹子（两个亚基） （2围绕双螺旋形成一个 环，模板链从该环通过） 夹稳模板并沿模板滑动 复合物 夹子装载,亚基与模板的结合,DNA-pol全酶（二聚体）每一个单体都具有催化活性，一个作用于领头链，另一个作用于随从链，使两股链在同一位置沿同一方向进行合成。,5,DNA pol同时合成两条子链,主要复制酶,参与DNA损伤的应急状态修复,修复合成 切除引物 填补空缺,功能,20,40,400,分子数/细胞,10,1,1,亚基数,+,5 外切酶活性,+,+,+, 5外切酶活性,+,+,+,5 聚合酶活性,pol III,p

9、ol II,pol I,原核生物的三种DNA聚合酶,（二）真核生物的DNA聚合酶,分子量 （kD）,53 聚合活性,35 外切活性,功能,16.5,40,14.0,12.5,25.5,中,起始引发 引物酶活性,-,+,？,高,高,高,+,+,-,低保真度的 复制,线粒体DNA的 复制,延长子链的 主要酶 解螺旋酶活性,填补引物空隙 切除修复 重组,为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关： 1遵守严格的碱基配对规律； 2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择(pol 亚基)； 3对复制过程中出现的错误及时进行校正。,三、DNA复制的保真性(fide

10、lity)：,DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现外切酶活性。,四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,E. Coli 基因图,目 录,1、解螺旋酶(helicase),利用ATP供能，使DNA双螺旋解开成两条单链,解螺旋酶,2、单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB),保持模板处于单链状态 保护单链的完整，避免核酸酶的降解,

11、依赖DNA的RNA聚合酶。 对利福平不敏感。 可以催化游离NTP聚合。 在大肠杆菌中，是DnaG,引物（primer）： 是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3-OH末端。,3、引物酶(primerase),4、DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),拓扑是指物体或图像作弹性移位而又保持原有的性质。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象。,拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,曾用名,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子

12、两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）,作用机制,拓扑异构酶 I 的作用方式,拓 扑 酶I,拓扑酶I 切断DNA双链中的一股，使两个螺旋变为一个，适当时候再封闭缺口,5、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP+Pi,5,3,5,3,缺口填补: 连接双股DNA分子中一链的缺口 双链DNA分子中双链的缺口 不能连接二分子单链DNA,DNA连接酶,

13、应用: 1.岗崎片段之间的连接. 2.DNA损伤修复中的连接. 3.一种重要的工具酶: 限制性内切酶切割后形成的粘性末端或平头末端的连接.,DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,1. DNA解链,解链过程,DnaA、B、C三种蛋白参与,DnaB 解螺旋酶,DnaC,DnaB 解螺旋酶,DnaC,解链过程,2. 引发体和引物,Dna A,SSB,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、

14、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,DnaG 引物酶,DNA 拓扑 异构酶 ,SSB,DnaG 引物酶,DNA 拓扑 异构酶 ,合成引物,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引发体的生成,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,3,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,5,3,OH 3,DN

15、A-pol III,复制的延长,领头链的合成,目 录,随从链的合成,目 录,复制的延长,下一个冈崎片 段起始位点,5,5,随从链上不连续性片段的连接,3,或RNA酶,冈崎片段的连接,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止,复制叉,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶

16、段发生DNA聚合酶/转换； 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNase H和FEN1等。,真核生物与原核生物DNA复制的差异：,酶及有关因子蛋白质（英文代号） 功能 DNA聚合酶（pol） 引发及后随链的部分合成 DNA聚合酶（pol） DNA复制主要酶 增殖细胞核抗原（PCNA） 滑动夹，与合成连续性有关 拓扑异构酶（TopoI，TopoII ） 母链DNA拓扑异构化 解（螺）旋酶 解开DNA双螺旋 复制蛋白A（RPA） 结合单链DNA 复制因子C（RFC） 参与滑动夹子的装配 DNA连接酶 连接冈崎片段 核酸酶H（RNaseH） 去除RNA引物 侧翼核酸内切酶I（FENI） 去除RNA引物

17、,真核生物DNA复制的两种主要聚合酶及有关蛋白因子, 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。,（一）复制的起始,目 录,领头链,随从链,（二）真核生物复制的延长,亲代DNA,DNA复制与核小体装配同步进行。,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,复制完成后子链末端留下空隙，母链成单链,端粒的结构特点, 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含T 、 G碱基的短 序列。,（三）真核生物端粒的复制,真核生物染色体线性DNA分子末端的结构,端粒酶(telomerase),作用： RNA模

18、板 逆转录酶,端粒酶的分子结构,组成： 端粒酶RNA 端粒酶协同蛋白 端粒酶逆转录酶,端粒DNA末端,1、端粒酶靠hTR（AnCn）x 与母链DNA端粒结合,2、以端粒酶RNA为模版，逆转录，延长DNA母链,3、端粒酶移位、空出RNA模板，再次延长母链，同时DNA母链反摺利于下游复制延伸。,4、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以DNA-Pol 。此时母链3-OH反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。,DNA-Pol,端粒及端粒酶的意义,体细胞端粒比生殖细胞端粒短； 老化与端粒酶活性下降有关； 肿瘤的发生与端粒酶活性有关； 端粒酶不一定能决定端粒的长度。,抗肿瘤靶点,逆转录和其他复制方式

19、 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),一、逆转录病毒和逆转录酶,一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录过程：,逆转录,HIV的生活周期,HIV增殖迅速，每天产生109-1010病毒颗粒。,二、逆转录及逆转录酶的生物医学意义,1. 丰富和发展了中心法则,2. 丰富和发展了致癌理论,3. 在基因工程中的应用,RNA也可作为遗传信息的载体,癌基因与病毒致癌理论,三、滚环复制和D环复制,滚环复制(roll

20、ing circle replication)：是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制的过程,滚环复制,D环复制(线粒体),第一引物以内环为模板延伸,第二引物（反向）以外环为模板进行反向延伸,DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair,第五节,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,常见的DNA的损伤包括碱基替代、脱落、碱基修饰、交联、链的断裂、重组等。,从分子水平来说，由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为突变，也称为DNA的损伤,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,自发性: 自然错配率约为10-910-10 左右。 物理因素: 如UV (ultra violet)、各种辐射。 化学因素: 烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质。 生物因素:黄曲霉素、病毒和抗生素类等。,三、突变的分子改变类型,错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入