课题3　血红蛋白的提取和分离 (6).ppt

1、课题3 血红蛋白的提取和分离,1、含量：占细胞干重的50以上，是细胞中含量最多的有机化合物。 2、组成元素：C、H、O、N 3、基本单位：氨基酸,蛋白质小知识,氨基 NH2,COOH 羧基,H,R,4、分子结构： 氨基酸 多肽 蛋白质 肽键：CONH 5、相对分子质量：高分子化合物,蛋白质小知识,脱水缩合,盘曲折叠,一、基础知识： （一）蛋白质提取和分离原理 （二）蛋白质提取和分离的方法 1）凝胶色谱法：又称分配色谱法 2）电泳法 （三）缓冲液的作用,二、实验操作实验步骤,1、分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2、蛋白质的分离

2、和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,思考,蛋白质提取与分离的依据 蛋白质的物理化学性质差异： 1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力,凝胶色谱法（分配色谱法）,1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,性质：微小的多孔球体 本质：多糖类化合物 实例：葡聚糖、琼脂糖,凝胶色谱法分离蛋白质,凝胶色谱法（分配色谱法）,2、原理： 当相对分子质量不同的蛋白

3、质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,2凝胶电泳法：,1）原理：,不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。,2）影响蛋白质分子运动速度的因素,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,思考：蛋白质为什么带有电荷？,在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷,3）常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰

4、胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,影响蛋白质分子运动速度的因素,缓冲溶液,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。 2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。 3、配制：通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。,还记得人体血液中的缓冲液吗？,H2CO3 /NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4,你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？,本实

5、验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。,电泳,1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3、类型：琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳 应用：测定蛋

6、白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定 原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 SDS：消除净电荷对迁移率的影响。,电泳,实验操作步骤,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,实验操作小视频,1、 红细胞的洗涤 2、血红蛋白的释放 3、分离血红蛋白溶液 4、透析,（一）样品处理,血液组成成分,阅读思考： 血液由_和_两部分组成。 血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_。 该化合物是由 _和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,问题： 1、刚采集的血样要做 怎样的处理？为什么？ 加入抗凝血剂， 防止血液凝固。 2、怎样洗涤？ 采样

7、分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次 低速短时间离心 生理盐水,1、红细胞的洗涤,3、洗涤的目的是什么？ 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 4、洗涤干净的标志是什么？ 直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。,1、红细胞的洗涤,1.洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？,血液 100mL,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,血红蛋白的组成, ,血红素基团,可携带一分子O2或一分子CO2,2.释放血红蛋白,阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加

8、入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞 混合液,烧杯,有机溶剂 血红蛋白,分 液 漏 斗,有机溶剂（无色透明的甲苯层） 脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层） 血红蛋白溶液（红色透明液体） 红细胞破碎物沉淀（ 暗红色沉淀物）,3、分离血红蛋白溶液,高速离心滤纸过滤漏斗分液,4.透析血红蛋白,透析的目的是什么？,去除血红蛋白中的小分子杂质,透析的原理及目的？,（二）凝胶色谱操作,1、 凝胶色谱柱的制作 打孔挖穴安管覆网纱包插管 2、凝胶色谱柱的装填 固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡 3、样品的加入和

9、洗脱 调节缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床洗脱收集分装蛋白质,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液 “G”表示什么？75代表什么？,2、凝胶色谱柱的装填 固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡,（二）凝胶色谱操作,3.样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样 3.再调液面,4.洗脱,5.收集,3、样品的加入和洗脱 调节缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床洗脱收集分装蛋白质,（二）凝胶色

10、谱操作,蛋白质的提取和分离步骤,1、样品处理 通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集血红蛋白溶液。 2、粗分离 经过透析去除分子量较小的杂质。 3、纯化 通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白质除去。 4、纯度鉴定 通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。,收集得到的纯化后的血红蛋白,问题： 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？ 让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。,注意事项,1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2.色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 3. 凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除

11、去微生物和气泡 4. 色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。,Why？,知识总结,血红蛋白的提取和分离,练习巩固： 1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（ ） A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质 2、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（ ） A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异,D,B,3、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（ ） A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质 D 二者根本无法比较 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是（ ） A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防