课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

1、多聚酶链式反应扩增DNA片断,课题二,主讲人：龚欣悦,1概念：PCR即_，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。,多聚酶链式反应,DNA,遗传疾病的诊断、 刑侦破案、 古生物学、 基因克隆 DNA序列测定。,2 、PCR技术 的应用,一、基础知识,（一）回忆DNA的复制 回答相关问题,1、发生时间：,发生在细胞有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期。,2、特点(方式)：,边解旋边复制,半保留复制,多起点复制,3、合成条件,模板：,原料：,游离的脱氧核苷酸,DNA两条链,能量：,ATP,酶:,解旋酶、DNA聚合酶,反应条件温和,4、场所：,

2、细胞核(主)、线粒体、叶绿体,DNA母链：提供复制的模板 解旋酶：打开DNA双链 4种脱氧核苷酸：合成子链的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子链 ATP：为复制过程提供能量 引物：使DNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸,（二）DNA复制的条件,脱氧核苷酸结构,1DNA的平面结构：,碱基,脱氧核糖,磷酸基团,碱基,脱氧核糖,碱基,脱氧核糖,磷酸二酯键,DNA3端，5端指什么。,DNA的羟基(-OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。,脱氧核苷酸 链 结构,5，端含磷酸基团,3，端含羟基,3，端,5，端,DNA聚合酶的特性 - 专一性,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端

3、延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。,观察图 2复制的方向：,2 方向：子链的5端向 3端延伸。,（1）、 DNA 分子的热变性原理,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,变性的目的：,解开双链:解开氢键,在80100 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为,2、PCR原理,变性,高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。,（2）、Taq DNA聚合酶的应用,（3）、PCR 反应的条件,DNA模板； 分别与两条模板链相结合的两种引物

4、（引物和引物）； 四种脱氧核苷酸； 耐高温的聚合酶（Taq DNA聚合酶）； 控制温度，但不需解旋酶； 需要在一定的缓冲液中进行。,PCR 反应需要的这些条件的原因是什么？,时间（min）,温度,（）,适温延伸,高温变性,低温复性,重复13步30轮,（1）、步骤：变性 复性延伸,二、PCR的反应过程,变性95oC,5,引物1,5,引物2,5,5,模板DNA,2530 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。,2、PCR的反应结果,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸, DNA聚合酶只能特异

5、性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,三、 PCR反应的实验操作,1、PCR仪,设备及用具,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,实质上一台能够自动调控温度的仪器,三、 PCR反应的实验操作,（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）,PCR技术

6、高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：,（6）、注意事项,隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；,分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头,四、结果分析与评价,DNA 含量的测定：稀释对照调零 测定计算（ DNA含量（g/mL）50(260nm的读数)稀释倍数）,波长260nm处读数,蒸馏水做对照,50倍,（一）理论上DNA扩增数目的计算,四、课题成果评价,1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n,2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n,（二）实验中DNA含量的测定,原理,可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关,五、 课题延伸,例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达2