分子生物学课件：2016秋季五年制实验课1

1、分子生物学实验,实验课安排,实验一 基因组DNA的制备和目的基因扩增 1、DNA提取技术 2、DNA扩增技术 实验二 PCR产物的T-A连接及连接产物转化,一、加样器的使用及注意事项 1、 用途 2、 使用,2.1 根据取样量，选择合适的加样器。 5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器?,顶部标有加样器的最大量程， 分别为： 20ul: 0.5 20 l 100ul: 20 100 l 1000ul: 100ul 1000 l,实验仪器的使用及注意事项,练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少?,2.2 如何调节？,(1)首先观察目前读数,假设为050: 1000 l: 500 l

2、 100 l: 50 l 20 l： 5 l (2)顺时针调节- 读数变小 逆时针调节- 读数变大 (3)注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。,2.3 加样器使用步骤(示教及学生练习)：,6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！),贴容器内壁，将液体匀速打出，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内.,5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去,4）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒钟, 急于离开液面，容易

3、吸入空气。,3）将吸头插入液面下适当深度，过深可能会腐蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。,2）吸取液体前，先打到第一挡。,1）选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安装要紧密。不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下,1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。,二、离心机的使用注意事项,1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。,3、样品配平, 对称放入离心机(管的连接处朝外). 4、设定离心时间(如设定2分钟，可定时多点时间，再用手表记时)。 5、统一离心，逐渐升到要求转速。,实验一、基因组DNA制备和目的基因扩增,实验背景,高等生物的基因组相当宠大。 真核细

4、胞基因组约含万个结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的。 而进行这些研究的起点就是要获得纯度高（不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染）、得率好（以便有足够量用于分析）、基因组相对完整以便用于以后分析、RFLP分析、基因文库的构建、基因探测等研究。,掌握从小鼠肝脏组织中提取基因组DNA的技术 掌握PCR扩增目的基因的原理和方法 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和技术,第一部分：基因组DNA的制备（肝组织制备、蛋白酶k消化、酚氯仿抽提、乙醇沉淀

5、） 第二部分: 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳 第三部分：PCR扩增目的基因,实验流程：,实验目的：,1. 取新鲜小鼠肝组织（约300-500mg），小米粒大小，组织块不宜过大, 放在毛玻璃片上立即研磨,研磨要彻底。 2. 将研磨后的肝组织转移至加有460 l NE溶液的EP管中，混匀。,实验第一部分：基因组DNA的制备（肝组织制备、蛋白酶k消化）,注意事项： 组织磨得越细越好。,注意事项： 离心时离心机内样品配平后，对称放置；加样器的正确使用。,加样器使用提示： （1）吸头的安装要紧密。 （2）打到第一挡，将吸头插入液面下适当深度（3）缓慢松开拇指，吸取液体。拇指完全放开后，吸头在液面下停留一

6、下（约半秒钟）（4）将外壁液体用容器口引流回容器。吸头内的体积应大致正确。（5）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出。,1000 r/m,离心5min (统一离心)，将上层细胞悬液转移至另一EP管中，用NE溶液补足至500 l，弃掉下层大块的组织沉淀。 加30 l 10%SDS, 迅速混匀。 加50 l 蛋白酶K(20mg/ml),混匀，置50水浴50min。,真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步: 1) 破碎细胞 2) 去除蛋白质，糖类等等生物大分子 3) 沉淀核酸,由于真核细胞基因组较大，在提取基因组DNA的操作过程中应注意动作轻柔，且

7、在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。,乙醇沉淀,SDS裂解 蛋白酶K消化,琼脂糖电泳,PCR,基因组DNA提取步骤图解,酚氯仿抽提,作用：a.阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性 c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用,成分：N: NaCl 50mM E: EDTA.Na2 25mM (PH:8.0) 作用：金属离子螯合剂，抑制DNase的活性 (螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子)。,各种试剂的作用,1、NE 溶液：,2、SDS ：十二烷基硫酸钠 终浓度0.5%,3、蛋白酶K(或链霉蛋白酶),作用：广谱蛋白酶，

8、能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。,重蒸酚: 酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。 无色 酚的氧化产物(如醌等,粉红色) 破坏磷酸二脂键。 重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。 TE溶液 : Tris-HCl 10mM (pH:8.0) EDTA.Na2 1mM (pH:8.0) 作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。 在酸性条件下，DNA分配于有机相。 8-羟基喹啉： 0.1% 黄色酚相指示剂 抗氧化剂,作用： 去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，可使样品中的蛋白质变性，通过离心去除。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的

9、酚。,4、TE饱和重蒸苯酚：,成分：,氯仿作用： a. 氯仿的变性作用不如酚好， 但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果； b. 氯仿有加速有机相和水相的分离、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性。,5、酚/氯仿,6、氯仿/异戊醇 ( 24 : 1),氯仿的作用： 去除DNA水溶液中残留的微量酚。 异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。,在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA发生沉淀。,8、无水乙醇 ：,作用：提供单价阳离子。,7、醋酸钠：3M NaAc pH: 5.2,核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。 最常用沉淀剂为

10、1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等 常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等,6、加入580 l(等体积)TE饱和酚, 混匀1min，10000rpm离心2min。(注意抽取下层酚相; 轻柔混匀，避免DNA链断裂;),实验第一部分 ：基因组DNA的制备（酚氯仿抽提、乙醇沉淀）,10、加入2-2.5倍体积无水乙醇（约1ml）混匀后置-70 沉淀10min。,9、将上层水相移至一新管中。加入1/10体积（约30 l）醋酸钠于上清中充分混匀。,8、 将上层水相移至一新管中。加入500 l(等体积)氯仿-异戊醇，混匀1min，10000rpm离心2min。,7

11、、将上层水相移至一新管中。加入500 l(等体积)酚/氯仿，混匀1min，10000rpm离心2min。 (要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。,注意事项： 本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，所以本次实验我们在抽提后总是取上清。 在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器,加完样后立即弃掉加样器头。 基因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作。,一定要充分 溶解沉淀,12、加入15 l双蒸水，溶解沉淀。,11、10,000 r/min离心5min

12、， 吸弃上清、滤纸条吸干内壁液体(勿触及DNA沉淀)， 37孵箱干燥至沉淀变透明。,余10 l：进行电泳,取5 l放入新管：作为PCR 模板,蓝头,黄头,滤纸条,(吸干内壁液体),观察DNA沉淀的颜色。,实验第二部分、基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测,一、琼脂糖凝胶电泳原理,DNA分子在 pH 8.0 的电泳环境中，带负电荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极迁移。 电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量较小的DNA片段跑在前面。,2. 上样： 在样品中加 1

13、ul 10上样 液，混匀，加入上样孔内。 各组按顺序上样,二、 琼脂糖凝胶电泳实验操作,制备1%琼脂糖凝胶 （实验老师准备）,3.电泳： 100110V，30-40分钟,三、琼脂糖凝胶电泳常用试剂,上样液成份： 10.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯青（样品指示剂） 240%蔗糖 或 30% 甘油（增加样品比重利于加样） 电泳缓冲液： TAE 为例 T: Tris碱 A: 冰醋酸 E: EDTA 提供有一定缓冲能力的pH值(8.0), EDTA可抑制DNase 溴化乙锭（EB）：染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA 的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。,致癌剂,

14、线性DNA片断大小（kb） 琼脂糖浓度（%） 5 60 0.4 0.8 10 0.7 0.4 6 1.0 0.2 4 1.5 0.2 3 1.75 0.1 3 2.0,四、 琼脂糖凝胶的浓度选择,五、 电泳仪的使用方法,稳压: 电流旋钮调到最大，再根据需要调节电压。 如箭头所示。,六、预期结果,如果是Smear带，说明所提基因组DNA的断裂现象严重。,1 2 3 4 5 marker,理想结果,实验第三部分、PCR扩增目的基因,去离子水 36l 10X PCR buffer (含MgCl2 ) 5 l dNTPs (10mM) 1 l 3 引物 (10mol/L) 1 l 5 引物 (10mol/L) 1 l 模板DNA 5l Taq DNA 聚合酶(2U/l) 1 l,3. 轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下； 4. 将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。,取 1 支200 l 微量离心管，用 Marker 笔 在管的侧面 标记； 2. 依次加入下列试剂：,94 30 S 变性 (Denaturation) 55 30 S 退火