生物化学课件：11第十六章 RNA的生物合成1

1、,第十六章 RNA的生物合成,RNA Biosynthesis,RNA合成的两种方式,转录 (transcription),生物体以一段DNA单链为模板合成RNA的过程。,RNA,DNA,产物：mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、miRNA,编码链,模板链,NTP,DNA依赖的RNA聚合酶,复制和转录的相同点,1、都是酶促的核苷酸聚合过程，聚合过程 都是核苷酸之间生成磷酸二酯键; 2、都以DNA为模板; 3、都需依赖DNA的聚合酶; 4、合成方向：5， 3，； 5、都遵从碱基配对原则。,复制和转录的区别,复制,转录,模板 两股链均复制 模板链转录 全部基因组被复制 仅部分基因转录 原料

2、dNTP NTP 酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 产物 子代双链DNA mRNA，tRNA，rRNA 配对 A-T，C-G A-U，C-G，T-A 引物 需要 不需要,第一节,原核生物转录的模板和酶,RNA转录体系,原料:NTP,模板:DNA（合成方向：5， 3，）,酶:DNA依赖的RNA聚合酶 RNA polymerase, RNA-pol,蛋白质因子及无机离子,一、原核生物转录的模板,不对称转录 (asymmetric transcription) 在DNA分子双链上，按碱基配对规律能指导转录生成RNA的一股链作为模板指导转录，另一股链则不转录，这种模板选择性称为不对称转录。,结构基因,不

3、对称转录 (asymmetric transcription),1、在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板 指引转录,另一股链不转录; 2、模板链并非总是在同一条单链上。,模板链:DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股 单链,称为模板链(template strand)。 编码链:与模板链互补的另一条链是编码链(coding strand)。 转录产物RNA的碱基序列，除了T变U外，其余与编码链相同。,二、RNA聚合酶催化RNA合成,（一）RNA聚合酶能从头启动RNA链的合成,(NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPi （不需要引物）,3,5-磷酸 二酯键,（二）

4、RNA聚合酶由多个亚基组成,2 ,2 （）,36512,决定哪些基因被转录,150618,催化聚合反应,155613,结合DNA模板，双螺旋解链,70263,辨认起始点，结合启动子,亚基,分子量 功 能,大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的功能, 11000 功能不详,核心酶 (core enzyme),全 酶 (holoenzyme),转录延长阶段,转录起始阶段,大肠杆菌内有一些不同的RNA pol全酶，其差 异是亚基的不同。 目前已发现多种亚基，并用其分子量命名区 别，最常见的是70（分子量70 kDa）。 但有些基因的启动子，如热激蛋白则被另外 的亚基（32 ）识别。,亚基,三、RNA聚合酶结合

5、到DNA的启动子上启动转录,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个基因的编码区及其调控序列。,操纵子：转录单位或转录区段,启动子,RNA-Pol,启动子提供转录起始信号，是RNA聚合酶全酶结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。,调控序列,-35,原核生物的RNA聚合酶,及其在转录起始区的结合,TTGACA,TATAAT,+1,+20,-10,-40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 +1 +5 +10 +15 +20 +25,启动子保守序列,开始转录,转录起始点,-35区 识别序列,-10区 Pribnow box,原核生物的

6、转录过程,第二节,RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,一、转录起始需要RNA聚合酶全酶,转录起始需解决两个问题：,2.开放转录复合体 DNA双链局部解开,1.闭合转录复合体 RNA聚合酶全酶(2)识别并结合启动子，此时DNA保持完整的双螺旋结构；,3.转录起始复合物 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录起始过程：,四磷酸二核苷酸,E.coli的转录起始,第一个磷酸二酯键生成后， 亚基即

7、从转录起始复合物上脱落,小 结,1、亚基辨认转录起始点-35区（TTGACA）序列，在-10区 （TATAAT）解开部分双螺旋。 2、DNA双链解开的范围通常是17bp左右。 3、转录起始不需引物。 4、5，端第一个核苷酸总是GTP或ATP（GTP更常见）。 5、转录起始复合物： RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 6、第一个磷酸二酯键形成后亚基即从转录起始复合物上脱落。,亚基脱落，RNApol核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移，在核心酶作用下NTP不断聚合，RNA链不断延长。 (NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,延长方向5， 3，,

8、二、 RNApol核心酶独立延长RNA链,转录延长小结,转录复合物形象地被称为转录泡； RNA聚合酶可以覆盖40bp以上长度的DNA； 转录解链范围小于20bp，通常是17bp左右 ； RNA/DNA杂化双链长度约8bp 。 核心酶负责RNA链延长，酶是沿着模板链的3 5方向前进，RNA链的合成方向是5-3； 模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解 链和再复合的动态变化。,RNA-pol（核心酶）- DNA RNA,5,3,DNA,三、原核生物转录延长与蛋白质翻译同时进行,核糖体,RNA,RNA聚合酶,在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行； 在新合成的mRNA链上结合有多个核糖体。,

9、羽毛状现象,四、转录终止,指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,分类 1、依赖Rho ()因子的转录终止 2、非依赖Rho因子的转录终止,因子是一种能够控制转录终止的蛋白质； 是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分 子量46kD。 因子能结合RNA，又以对polyC的结合力最强。 因子两种酶活性： ATP 酶 解螺旋酶,1、依赖因子的转录终止,因子：,2.非依赖 因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,转录终止机制：RNA末端,茎环/发夹结构 连续U,近终止区的转录产物形

10、成茎环结构及连续U， 是非依赖因子终止的普遍现象。,转录终止的机理：,茎环结构使RNA聚合酶变构，转录停顿； 多个连续的U使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,真核生物RNA的生物合成,第三节,一、真核生物有三种DNA依赖的RNA聚合酶,RNA聚合酶是真核生物中最活跃、最重要的RNA聚合酶,RNA聚合酶的组成,小亚基：十几个,大亚基：2个,3种真核生物RNA聚合酶都有核心亚基，与大肠 杆菌RNA聚合酶的核心亚基有一些序列同源性； 除核心亚基外，3种真核生物RNA聚合酶都具有5 个共同小亚基； RNA聚合酶由12个亚基组成。,羧基末端结构域( CTD) RNA聚合酶最大亚基的羧基末端有一段共有

11、序列，为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段。 所有真核生物的RNA聚合酶都有CTD，而RNA聚 合酶和没有CTD; 功能：对于维持细胞的活性是必需的。,起始阶段：CTD去磷酸化 延长阶段：CTD磷酸化,CTD的可逆磷酸化在真核生物转录起始和延长阶段发挥重要作用,二、转录起始,1、RNA聚合酶 2、启动子 3、转录因子,与原核生物不同，真核生物转录起始时，RNA聚合酶不能直接识别和结合模板的起始区。,（一）转录前起始复合体的形成,可影响自身基因表达活性的特异DNA序列统称为顺式作用元件(cis-acting element) 。,顺式作用元件:,启动子 增强子

12、沉默子,包括:,基因组中的顺式作用元件是转录起始的关键调节部位,顺式作用元件,转录起始,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,启动子核心序列,启动子上游元件,TATAAAA,真核生物的启动子至少包括一个转录起点及1个以上的功能组件。,转录因子（TF),转录因子/反式作用因子 能直接或间接识别和结合启动子及其上游调节序列等顺式作用元件的蛋白质属于转录因子。 通用转录因子 直接或间接结合RNA聚合酶，为转录前起始复合体装配所必需的蛋白质称为通用转录因子或基本转录因子。,转录因子分类,转子录因（TF ） 转子录因（TF ） 转子录因（TF ）,TF ,TF D TF A TF B TF F TF

13、E TF H,TBP（TATA结合蛋白） TAFs（TBP辅助因子）,转录前起始复合物,真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录前起始复合物( PIC)。,启动子 RNA聚合酶 转录因子,三、转录延长,RNA-pol前移处处都遇上核 小体； 体外转录实验可以观察到转 录延长过程中核小体移位和 解聚现象。 转录延长同样需要众多转录 因子的参与。,真核生物没有转录与翻译同步的现象。,四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行,真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相关的。 真核生物mRNA聚腺苷酸(polyA)尾巴结构，是转录后才加进去的。 在读码框架的下游，常

14、有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点。 转录不是在转录终止的修饰点位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿。,真核生物的转录终止及加尾修饰,3processing,5mGpppGAAUAAAPoly（A）,3 ,5,PAUSE,3,5,Release,5AAUAAA,GUGUGUG,转录终止修饰点,mRNA,AATAAAGTGTGTG,原核生物与真核生物转录的异、同点,原核生物,真核生物,转录的起始,RNA聚合酶与模板DNA分子直接结合,RNA聚合酶不与模板DNA分子直接结合，需依靠众多转录因子,转录起始点,-35区及-10区,-25

15、-30区,转录的延长,基本相似，只是催化的酶不同，都是转录空泡沿着模板链向前滑动，转录出相应的RNA，但真核生物需要许多转录因子参与,转录终止,依赖因子、和非依赖因子的转录终止,依赖模板链末端特殊的转录终止修饰点,转录与翻译不同步,转录与翻译同步,真核生物RNA的加工 和降解,第四节,一、真核生物mRNA的加工,5-末端加入“帽”结构 3-末端加上多聚腺苷酸尾 mRNA的剪接 mRNA编辑,前体mRNA：也称为初级mRNA转录物，hnRNA或杂化核RNA,（一）前体mRNA在5端加入“帽”结构,1、部位：mRNA的5-末端 2、成分：7-甲基鸟嘌呤核苷 3、时间：hnRNA合成大约25-30个

16、核苷酸时加帽。 4、方式：5 ，5 三磷酸连接键 5、酶 鸟苷酸转移酶 甲基转移酶,ppp5 NpNp,帽子结构的生成过程,帽子结构的意义,1、可以使mRNA免遭核酸酶的攻击； 2、与帽结合蛋白质复合体结合，参与mRNA 和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。,PolyA的形成,（二）3端末端加上多聚腺苷酸尾,断裂点,加尾小结,1、真核生物中除了组蛋白的mRNA，在3端都有 多聚腺苷酸尾巴； 2、尾部修饰和转录终止同时进行; 3、PolyA尾的功能： 1）维持mRNA作为翻译模板的活性 2）增加mRNA稳定性 4、PolyA的长度一般在80-250个核苷酸之间，其 长度随mRNA的寿命而缩短。

17、,1、断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,（三）mRNA的剪接,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区 互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接 后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些 基因称为断裂基因。,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录后修饰,1.2kb,386aa,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,大多数内含子剪接部位具有共同的结构序列： 剪接接口：5端从GU开始，3端终止于AG,G U A/G A G U C U A/G A C/U,A/C A G,N C A

18、 G G,5外显子,5剪接位点,分支点,内含子,3剪接位点,3外显子,嘧啶富含区 （15b),hnRNA,2、mRNA的剪接, 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,mRNA前体中的内含子是以所谓“套索”结构的形式被切除 ；,剪接过程需两次转酯反应。,2,1,2,1,第一次亲核攻击,第一次亲核攻击,内含子剪接场所:剪接体(snRNP),snRNA：5种 ( U1、U2、U4、U5、U6） 蛋白质：50多种,分类（5种）,U1snRNP U2snRNP U4snRNP U5snRNP U6snRNP,snRNP（小核糖核蛋白颗粒）,组成,各种snRNP在内含子剪接过程中先后结合到hnRNA上，使内含子形成套索结构，拉近上、下游外显子，通过两次转酯反应完成剪接。,3、前体mRNA分子有剪切和剪接两种模式,剪切：就是剪去内含子，然后在上游的外显子3 端直接进行多聚腺苷酸化，不进行相邻外显子 之间的连接反应；