自身免疫性疾病相关检测.ppt

1、自身免疫性疾病相关检测,Qingmao Geng,自体免疫性疾病（Autoimmune disease），亦作自体免疫问题，是一种人体内自己的免疫系统攻击自己身体正常细胞/组织/器官的疾病，就是正常的免疫能力下降，而异常的免疫能力却突显的一种问题。 自身免疫病的特点： 多数病因不明，常呈自发性或特发性； 多数病程较长，多呈反复发作和慢性迁延过程； 某些具有遗传倾向； 多数疾病女性多于男性； 多数患者血清中可以检测到抗核抗体或其它自身抗体；,自身免疫性疾病,分类：系统性，组织器官特异性。 目前主要的疾病包括：,主 要 疾 病,涉及的科室：风湿免疫科、皮肤科、呼吸内科、血液科、肾内科、消化科、骨科

2、、保健科、神经内科等。,传统定义：针对细胞核成分的自身抗体的总称。 广义定义：针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA 的理解不再局限于核成分，而是指核酸和核蛋白抗体的总称 ANA的靶抗原分布： 细胞核 整个细胞，包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期蛋白等。 ENA：抗可提取核抗原，包括RNP/Sm, Sm, SSA, SSB, Scl-70和Jo-1等 六种靶抗 原,抗核抗体的定义,抗核抗体主要检测方法,间接免疫荧光法：最经典，金标准！ 酶联免疫吸附试验（ELISA）：可定量 免疫印迹法（WB）：特异性非常好 线性酶免：兼顾特异性、敏感度 放射免疫法：灵敏度好,抗核抗体的主要检

3、测方法,美国风湿学会(ACR)立场声明,HEp-2 细胞包含大约100 至150 种自身抗原 其它初筛方法仅具有少量自身抗原 (8-10),大约 35% SLE患者和IFT-ANA阳性患者在其它初筛实验中为阴性结果,建议： IFT-ANA仍然为ANA检测的金标准!,ANA检测间接免疫荧光法(IFT), 抗原谱完整 (细胞核、细胞浆) 检测ANA的金标准，具有很高的敏感性和特异性 基质组合: HEp-2细胞+灵长类肝,根据产生的荧光模型、靶抗原的分布分类如下：,ANA,核均质型：DNA、组蛋白和核小体等,核膜型：板层素、gp210等,核颗粒型,核仁型：Scl-70、RNA多聚酶、PM-Scl和原

4、纤维蛋白等,核浆点型：着丝点、核点等,胞浆颗粒型：线粒体、Jo-1、核糖体等,胞浆纤维型：波形蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白等,分裂期细胞阳性：纺垂体、中间体、中心粒等,核糖核蛋白：Sm、nRNP、SS-A、SS-B,细胞核,细胞浆,Ku,细胞周期蛋白：I型（PCNA）和II型,抗核抗体荧光结果,荧光结果滴度的解读,SLE诊断标准（ACR2009年修订）,ANA检测的临床意义,系统性红斑狼疮 活动期 非活动期 药物诱导的红斑狼疮 混合性结缔组织病（MCTD、Sharp综合征） 类风湿性关节炎 进行性系统性硬化症 多发性肌炎及皮肌炎 干燥综合征 慢性活动性肝炎 溃疡性结肠炎 其它风湿病 正常人,95

5、100 80100 100 100 2040 2050 8595 3050 7080 3040 26 5-10,抗核抗体谱项目介绍,欧蒙印迹法 实验原理,实验原理 将抗原包被在固相膜片上，然后将膜片固定在合成膜条上。 若样本阳性，血清/浆中的特异性抗体与固相上的抗原结合。 结合的抗体与碱性磷酸酶标记的抗人抗体结果。 加入色原/底物液产生颜色反应。 依据所包被的抗原，可在相同条件下同时检测多种抗体。,ANA-3G 检测项目,ANA-3G各项自身抗体的临床意义,SLE,SjS,Scl,MCTD,PBC,PM/DM,话题: ANA全抗原检测与特异性检测,全抗原检测与特异性检测,HEp-2 cells

6、 + primate liver,+,ANA profile 3G,协和医院的临床研究,协和医院的临床研究,SSA and/or Ro52+ (n=11), Histone+ (n=1), Scl-70+ (n=1), Jo-1+ (n=1), M2+ (n=1),协和医院的临床研究,最新研究,IFT为阴性时，LIA的符合率为74.8% LIA为阳性时，IFT的符合率为81.1%,最新研究,IFT为阴性，而LIA为阳性的206例患者中,最新研究,原文中的讨论,最新研究,最终的结论,ACR的申明,荧光阳性而靶抗原阴性,如果所有的已知靶抗原都是阴性，那做荧光检测的意义是什么？,案例分析,47岁的中

7、年妇女，临床症状提示可能SLE，但ANA靶抗原检测全部阴性。 由于受到血清学检测结果的干扰，最终得出的诊断为皮肤结节性多动脉炎 专家提出质疑，要求用IFT方法重新检测ANA，发现为强阳性。 根据ANA-IFT的阳性结果，最终修正结果为SLE，由于正确的诊断，患者得到了良好的治疗 结论：不明靶抗原的ANA荧光阳性，是具有诊断意义的。,案例分析,SLE诊断标准（ACR2009年修订）,慢性炎症性结缔组织病 (CICTD),慢性炎症性结缔组织病 (CICTD),Systemischer Lupus Erythematodes (SLE),干燥综合征 (SS),系统性硬化症 (SSc),Rheumat

8、oide Arthritis (RA),多肌炎/皮肌炎 (PM/DM),类风湿性关节炎 (RA),系统性红斑狼疮 (SLE),ANCA 相关性血管炎,MPO and PR3,慢性炎症性结缔组织病 (CICTD),慢性炎症性结缔组织病 (CICTD),Systemischer Lupus Erythematodes (SLE),干燥综合征 (SS),系统性硬化症 (SSc),Rheumatoide Arthritis (RA),多肌炎/皮肌炎 (PM/DM),类风湿性关节炎 (RA),系统性红斑狼疮 (SLE),ANCA 相关性血管炎,MPO and PR3,侵犯皮肤和多脏器的一种全身性自身免疫

9、病。 某些不明病因诱导机体产生多种自身抗体(如抗核抗体等)，导致： 自身抗体与相应自身抗原结合为循环免疫复合物，通过III型超敏反应而损伤自身组织和器官； 抗血细胞自身抗体与血细胞表面抗原结合，通过II型超敏反应而损伤血细胞。,系统性红斑狼疮（SLE）,临床发病特点 发病率: 40/100,000(北欧);200/100,000(非洲);250,000 (美国) 患者寿命:4年/50%(1950); 15/80%(当前); 20岁诊断/35岁死亡几率1:6,SLE 各器官的表现,关于SLE的诊断经历了很长时间，其标准也不断修正和完善，基本上存在4个标准：,SLE标准,颊部红斑：固定红斑，扁平或

10、高起，在两颧突出部位，不累及鼻唇沟。 盘状红斑：片状高起的红斑，粘附有角质脱屑和毛囊栓，老的病变可发生萎缩性瘢痕。 光过敏：对日光有不寻常的反应引起皮疹，从病史得知或医生观察到。 口腔溃疡：经医生观察到的口腔或鼻咽部溃疡，一般无痛性。 关节炎：非糜烂性关节炎，累及2个或更多的外周关节，特征为压痛、肿胀、积液。 浆膜炎： a、胸膜炎明确的胸膜炎性疼痛史，经医生听到摩擦音或有胸腔积液。 b、心包炎心电图（ECG）记录，或心包摩擦音，或心包积液的证据。,1982年标准,肾脏病变： a、持续性蛋白尿，尿蛋白的定量每日超过0.5g或定性实验 + + +。 b、细胞管型，可为红细胞、血红蛋白、颗粒管型等或

11、混合性。 神经病变： a、癫痫没有诱发药物或已知的代谢紊乱，如尿毒症、酮症酸中毒或电解质紊乱。 b、精神病没有药物影响或已知的代谢紊乱，如尿毒症、酮症酸中毒或电解质紊乱。 血液学改变： a、溶血性贫血伴有网织红细胞增多。 b、白细胞减少2次或多次低于4.0109/L。 c、淋巴细胞减少2次或多次低于1.5109/L。 d、血小板减少在没有药物影响下低于100109/L。,1982年标准,免疫学异常： a、阳性LE细胞反应。 b、抗DNA抗体和抗天然DNA抗体滴度异常。 c、抗Sm抗体阳性，存在抗Sm核抗原的抗体。 d、假阳性梅毒血清试验，至少持续6个月，并经梅毒螺旋体固定试验或荧光螺旋抗体吸收

12、试验证实。 抗核抗体： 在任何恰当时间和在没有用药诱发“药物性狼疮”综合征的情况下，免疫荧光或其它相应的试验检测出抗核抗体滴度的改变。 用于临床研究鉴别病人，在任何观察期间，如上述11条标准中有4条以上同时出现，可以认为病人有系统性红斑狼疮。,1982年标准,临床标准 急性或亚急性皮肤狼疮表现； 慢性皮肤狼疮表现； 口腔或鼻咽部溃疡； 脱发 炎性滑膜炎，有2个外周关节肿痛或压痛伴晨僵； 浆膜炎； 肾脏病变：尿蛋白0.5g/24h，或有RBC管型； 神经病变：癫痫发作或精神失常，多发性单神经炎，脊髓炎，外周或颅神经病变，脑炎 溶血性贫血 WBC 4 X 109/L至少一次，或淋巴细胞 1 X 1

13、09/L至少一次； 血小板100 X 109/L至少一次。,2009年标准,免疫学诊断标准 ANA滴度高于正常值； 抗dsDNA高于参考值； 抗Sm抗体; 抗磷脂抗体阳性，即狼疮抗凝物阳性，梅毒血清学试验假阳性，抗心磷脂抗体水平升高； 补体降低，包括C3、C4和CH50； 直接抗人球蛋白（Combs）实验阳性（非溶血性贫血状态）。,2009年标准,确诊条件： 肾活检证实为LN（免疫荧光技术）：肾小球基底膜广泛的Ig、C3、C4、C1q沉积“满堂亮” 满足以上4条标准（包括至少一条临床标准和至少一条免疫学标准） 与以前标准的差别： 明确分为两类标准：临床标准和免疫学标准 增加了自身抗体的种类和比

14、重,2009年标准,SLE相关自身抗体,高特异性抗体,核均质型HEp-2-Cells/Primate liver,EUROIMMUN,- 检测方法: IIFT, Farr-法 (RIA), ELISA or Blot,抗dsDNA 自身抗体,高度特异性抗体 70%患者阳性 滴度与疾病活动性相关 抗体滴度上升但临床症状不明显的患者，抗体检测后5年内80%患者进入活动期,抗dsDNA抗体与SLE,用两种或两种以上的方法进行检测！,靶抗原：dsDNA-组蛋白-复合物的构象决定簇 方法：IIFA、ELISA、Blot 临床意义：SLE，阳性率5095%；特异性：接近100%,抗核小体抗体与SLE,AN

15、uA与疾病的活动性相关性强（SLEDAI score） Su et al., ClinImmunol122: 115-120, 2007,抗核小体抗体与SLE,抗核小体抗体与SLE,抗核小体抗体与狼疮性肾炎,LNTP = lupus nephritis requiring renal transplantation LN = biopsy proven lupus nephritis CON = SLE patients without nephritis,狼疮肾炎是SLE的一种潜在的严重并发症 (高达 50%) 1.2% 需要进行肾移植的患者有狼疮肾炎,伴有狼疮肾炎的严重SLE的生物标记物,

16、Stinton et al., Lupus 15: 394-400, 2007,U1-nRNP and Sm,Anti-Sm,Anti-U1 RNP,MCTD: 95-100% SLE: 15-40%,SLE: 530%,Anti-Sm and SLE,Elizabeth Benito-Garcia et al., Arthritis Care 1979),抗核周因子 (APF; 1964),靶抗原: 丝集蛋白,靶抗原: 前丝集蛋白,丝集蛋白,丝集蛋白 =上皮细胞表达的蛋白质, 连接角蛋白纤维. 前体: 前丝集蛋白,将精氨酸替换为瓜氨酸,CCP环瓜氨酸肽,- 瓜氨酸肽：线状还是环状?, CCP

17、 = Cyclic Citrullinated Peptide（环瓜氨酸肽）,抗RA相关角蛋白抗体,靶抗原：食管表皮中丝集蛋白和前丝集蛋白相关蛋白 基质：大鼠食道 相关疾病：类风湿关节炎早期诊断指标，特异性95%，敏感性30-45%。与疾病活动性及严重程度相关。 备注：与APF主要靶抗原重叠。,抗CCP抗体与抗角蛋白抗体的比较,阳性率 抗角蛋白抗体：42%; 抗CCP抗体：60%,抗CCP抗体对RA的敏感性更高,* IIFT滴度= 1:10（弱阳性）,抗CCP抗体与RF：敏感性, 敏感性相同 !,抗CCP抗体的临床意义,类风湿性关节炎的早期诊断： 在临床症状出现之前，抗CCP抗体即可出现阳性

18、在刚出现临床症状时，就开始合适的治疗 可减少不可逆的关节变形 阳性预告值如：抗CCP抗体阳性的患者，发展成为有关节损坏RA的几率高,抗CCP抗体：可出现于RA临床症状之前,年（开始出现RA症状前）,抗CCP抗体阳性的 RA患者,80% 60% 40% 20% 0%,10 8 6 4 2,Rantapa-Dahlqvist et al., Arthritis Rheum, 2003,从普通的关节炎（UA）发展到RA (318名UA患者：22%抗CCP抗体阳性、22% IgM-RF阳性）,抗CCP抗体：发展到RA的标志,RF抗体：最好G/M分型 抗CCP抗体 抗AKA抗体 抗APF抗体,RA实验室

19、检查,其他疾病中的抗核抗体,自身免疫性肝病,EUROIMMUN,胞浆纤维型荧光：确定是否是平滑肌抗体，考虑自身免疫性肝炎 胞浆颗粒型荧光：确定是否是线粒体，考虑原发性胆汁性肝硬化 核点型荧光：考虑原发性胆汁性肝硬化 核膜型荧光：考虑原发性胆汁性肝硬化,核点型,EUROIMMUN,核点型抗体,靶抗原: 大分子、核间质结合多蛋白复合物 至少4种自身抗原：Sp-100, PML, SUMO-1 和 -2 分析方法: IIFA, Blot 临床意义: 对PBC有特异性(10-30%),抗核膜抗体,EUROIMMUN,抗细胞核膜抗体,靶抗原: 核孔复合物、Lamine 细胞核孔复合体糖蛋白210 (gp

20、210) 细胞核孔复合体糖蛋白62 (p62) Lamin-B-受体 Lamin A, B, C 分析方法: IIFT, Blot，ELISA 临床意义: PBC gp210: 29% p62: 14-32% Lamin-B-受体: 1-3%,抗线粒体抗体 (AMA)HEp-2-Cells/Primate liver:,细胞浆粗颗粒: 抗线粒体抗体 (AMA),靶抗原: M1 M9: M2 (丙酮酸脱氢酶), M4 (亚硫酸氧化酶), M9 (糖原磷酸化酶 a). 分析方法: IIFA, ELISA, Blot 临床意义: PBC 患者出现抗体 M2, M4, M8 & M9 M2: PBC标

21、志性抗体 (阳性率 95%) M4 & M8: 阳性率较低或总伴有M2阳性 M9: PBC早期出现 (82%),抗F肌动蛋白抗体,EUROIMMUN,胞浆纤维: Anti-F-Actin,靶抗原: F-Actin抗原表位 分析方法: IIFA 临床意义: I型自身免疫性肝炎 (AIH)的重要自身抗体，阳性率 40-90%,自身抗体的预测价值（荧光）,多种相关自身抗体均可出现阳性,临床症状出现之后,临床症状出现之前,？,如何开展研究？,美国国防血清库：包含有完整记录的3000万份服役军人的全血。（每个现役军人每年需献血一次） 选取130个明确诊断为SLE的军人，用其每年所献的血做回溯性研究。（另选取390个对照） 将上述相关血样做ANA全抗原检测，及各ANA靶抗原特异性检测,研究方法,双链DNA.,第一个关注点,dsDNA抗体的产生早于SLE临床诊断,最早在发病9.3年前出现 平均出现时间为发病前2.2年,dsDNA抗体的产生早于SLE临床诊断,其他与SLE相关的特异性抗体的全面审视，以