第1节基因工程的基本原理和技术.pptx

1、,专题1 基因工程,DNA重组技术的基本工具 和基本操作程序复习,转基因抗虫棉是我国目前最主要的转基因作物，如何获得转基因抗虫棉呢？,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,知识网络构建,1.1基因工程的概念,一、基因工程的基本概念(原理)： “按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫DNA重组技术。,优点：定向改造生物的遗传性状以及克服远缘杂交不亲和障碍。,生物体外,基因,DNA分子水平,获得人类需要的基因产物或定向改造生物性状,基因重组(广义),

2、1抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,2抗虫基因与载体DNA连接,3抗虫基因导入受体(棉花)细胞,分子手术刀限制性内切酶 分子缝合针DNA连接酶 分子运输车基因进入受体细胞的载体,二、转基因抗虫棉操作的基本工具 ?,2基因工程的操作工具,(1)基因的“分子手术刀” 分布(来源)： 种类：约4000种。 作用特性： 切割结果：产生两个带有 末端或 末端的DNA片段。,限制性核酸内切酶(简称限制酶),主要存在于原核生物中。,黏性,平,识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并 且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键断开。(切割具有专一性),切割磷酸二酯键,EcoR,黏性末端,黏性末

3、端,Sma,平末端平末端,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？,要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。,为什么原核生物的限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？,DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列； 通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，限制酶不能识别。,2基因工程的操作工具,(2)分子缝合针 类型：,DNA连接酶,把切下来的具有互补黏性末端或平末端的DNA分子 拼接成新的DNA。 (即将脱氧核糖与磷酸通过 连接起来),磷酸二酯键,Ecoli-DNA连接酶,T4-DNA连接酶,大肠杆菌,T4噬菌体,都缝合磷酸二酯键,DNA连接酶：,Ecoli

4、DNA连接酶或T4DNA连接酶,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,T4DNA连接酶(可用于连接平末端，但连接效率低),限制性内切酶与DNA解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将DNA两条链的氢键打开形成两条单链,DNA连接酶与DNA聚合酶的区别,切割磷酸二酯键将DNA水解为单个核苷酸,易混辨析,只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键

5、连接成一条互补的DNA链,将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,你能辨析限制酶与DNA连接酶、 DNA聚合酶、DNA解旋酶作用不同点吗？,疑难解析,例1 如右图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示何种酶的作用？,限制酶,DNA 连接酶,解旋酶,DNA 聚合酶,2基因工程的操作工具,(3) “分子运输车”载体 条件： 常用载体：,a能自我复制：具有复制原点，在宿主细胞内 能够保存和复制;,b有一个或多个酶切位点，能够运载多种目的基因；,c有标记的基因，如抗性基因、特殊生化表型基因,d对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动,质粒、噬菌体衍生物、某些动植物病毒。,

6、常用的载体：质粒,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有一个至多个酶切位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别,质粒主要存在于细菌、放线菌和酵母菌等生物体内。 质粒是一种能自我复制的小型环状双链DNA分子。,填写概念图,二、培育转基因抗虫棉基因工程的基本操作程序 ?,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四个步骤,1、获取目的基因,2、构建重组质粒,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,怎样获得苏云金芽孢杆菌Bt毒蛋白基因？目的基因的获取常有哪些方法？,1、目的基因的获取,基因组文库法,cDNA文库法,PCR技术,人工合成法,基因组DNA文库,cDNA文

7、库,（1）基因组DNA文库与cDNA文库的比较,RNA聚合酶结合位点,RNA聚合酶脱落位点,真核细胞的基因结构(补充内容),编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子,外显子,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,转 录,加 工,mRNA前体,成熟mRNA,原核细胞的基因结构(补充内容),非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,：编码蛋白质 ,连续不间断(没有内含子),编码区,非

8、编码区,原核细胞的基因结构,RNA聚合酶脱落位点,不编码蛋白质。,调控遗传信息表达,上游有启动子,下游有终止子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,（2） 如果用PCR只扩增所需目的基因的关键前提和条件是什么？过程如何？原理是什么？,PCR技术,前提： 原理： 过程:,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列，合成引物,低温退火（复性）55-60 ,高温解链（变性）90-95,子链延伸70-75 循环,（2）目的基因的获取方法,PCR反应过程可分为三步：解链（变性）、退火(复性)、延伸,解链（变性）。双链模板DNA解离为单链结构。(9095),退火（复性）。引物与模

9、板互补成双链。,延伸。在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。7075,每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。,利用PCR技术扩增目的基因,易错辨析：PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶（taq酶）,细胞内的DNA聚合酶,1.已知DNA链的合成方向是53，若要扩增出抗虫基因并利于载体构建，应该选择下图所示的哪种引物？请说明理由。,抗虫基因,前提条件：基因比较小 ，核苷酸序列已知。 DNA合成仪用化学方法直接人工合成 设备：DNA合成仪,（3）目的基因的获取方法用D

10、NA合成仪人工合成目的基因,如何构建基因表达载体？基因表达载体包含哪些基本组成元件？通过cDNA文库提取的目的基因需要加启动子和终止子吗？,2、构建基因表达载体,基因工程的基本操作程序,构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以以传给下一代。 基因表达载体的组成：,2、表达载体的构建 基因工程的核心,启动子：位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需蛋白质。 终止子：位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来。 标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含目的基因，从而筛选出来。如：抗生素抗性基因 复制原点：使目的基因在受体细胞中稳定存在

11、，并且可以复制遗传给下一代,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,易混辨析,你思考过实际操作过程中,如何防止 酶切后的末端发生任意连接吗？,实际操作过程中，连接得到的DNA一定是重组DNA吗？ 操作：目的基因自体环化,基因表达载体构建时限制酶的选择,根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选用Pst和EcoR两种限制酶，但要确保质粒上也有这两种酶的切点。 根据质粒的特点确

12、定限制酶的种类 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重 组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。,基因工程的基本操作程序,3、将目的基因导入受体细胞转化,常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 导入方法：,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法

13、,感受态细胞,农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染 双子叶植物和裸子植物，受植物体伤口处的细胞分泌的大量酚类化合物的吸引，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA 可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,原理：将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌转化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞染色体的DNA上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。 优点及应用：此法比较经济和有效，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得。,1)将目的基因导入植物细胞,a.农杆菌转化法(采用最多的方法),我国科学家周光宇独创的一种方法 实例：我国的转基因抗虫棉,常用于单子叶植

14、物的基因转化 缺点：成本较高,b.基因枪法,c.花粉管通道法,1)将目的基因导入植物细胞,该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单。 缺点：受自然花期限制，在自然田间进行操作，受环境条件的影响很大。,花粉管通道法,十分简便经济,2)将目的基因导入动物细胞,最常用最有效的方法:显微注射技术,受体细胞：受精卵原因是：受精卵全能性较高，可使外源基因在相应的组织细胞内表达。 基本操作程序：,提纯基因表达载体,体外显微注射入受精卵,经胚胎早期培养后 移植到雌性体内,受精卵发育,新性状动物,3)将目的基因导入微生物细胞,应用最为广泛的受体细胞是大肠杆菌 方法：Ca2+处理法或者感受态细胞法 第

15、一步：用Ca2+处理细胞(以增加细菌细胞壁的通透性)，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞； 第二步：是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成.大肠杆菌是原核生物,不存在这两种细胞器,因此在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的.,如何检测Bt毒蛋白基因是否成功导入棉花?最简单直观的鉴定方法是?外源基因在受体细胞能够表达的理论基础？,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作程序,4、目的基因的检测与鉴定,1).抗

16、药性筛选法 利用标记基因,2).检测,导入检测,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,方法DNA分子杂交,表达检测,转录检测,翻译检测,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法分子杂交,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原抗体杂交,核酸子检测,分子水平杂交技术,3).鉴定个体水平检测：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,是否赋予个体新的遗传特征或产物。,利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆,检测方法：,1、DNA分子杂交技术,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做,探针；,通过检测标记基因和转录出的mRNA的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。,检测方法2：分子杂交技术,用DNA探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,检测方法3：免疫检测抗原-抗体杂交,检测