高中生物第1章微生物培养技术第3节测定微生物的数量名师精选教案中图版选修1

1、名校名 推荐第三节测定微生物的数量一、测定微生物数量的方法测定微生物数量的方法可分为两类：直接计数法和间接计数法。前者常用的是显微镜直接计数法，这种方法是先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。该方法适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。后者最常用的是稀释平板计数法，需要将待测样品配制成均匀的系列稀释液并使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后统计培养基中出现的菌落数，从而推算出样品中的活菌数。利用血球计数板测出的菌体数与平板计数法相比哪个多些？【提示】 血球计数板测出的是全部菌体数， 而平板计数法只能测出活菌数， 而且比实际数偏少。二、间接计数法的实验设计1制备土壤

2、稀释液取土壤表层5 10 cm 处的土样。准确称取1 g 土样，放入盛有99 mL 无菌水的锥形瓶中，振荡20 min 后制成 102 倍的稀释液。然后进行系列稀释，得到103、 104、 105、106 倍的系列稀释菌液。2取样及倒平板3培养4观察记录(1) 计数时对于细菌、放线菌以每个培养皿内有30 300 个菌落为宜，霉菌以每个培养皿内有 10 100 个菌落为宜。某稀释倍数的菌落平均数(2) 计算每克样品菌数公式为：每克土壤样品菌数稀细菌培养时所用的稀释液体积释倍数。预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中问题 1问题 21名校名 推荐问题 3问题 4一、微生物生长量的测

3、定1. 测重量法干重法：将单位体积待测的培养液离心后，用清水洗涤15 次，放入干燥器中加热干燥，加热温度一般在100105 之间，再称重。以细菌为例，一个细胞一般重约10 12 10 13g，也可在较低温度 ( 如 40 ) 下进行真空干燥。湿重法：将一定量的菌悬液离心或过滤，得到菌体，反复洗涤后称湿重，干重一般为湿重的 20% 25%。2计数法(1) 直接计数法这种方法是利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。 此法的缺点是不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特2225 个 ( 或 16 个 ) 中格，定的面积 1 mm 和高0.1 m

4、m 的计数室，在 1 mm 的面积里又被划分成每个中格进一步划分成16 个( 或 25 个) 小格，但计数室都是由 400个小格组成。将稀释的样品滴在计数板上， 盖上盖玻片， 然后在显微镜下计数4 5 个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数4001 000 稀释倍数(2) 间接计数法 ( 活菌计数法 )稀释平板涂布法，常用来统计样品中的活菌数。此法是根据微生物在固体培养基上所形2名校名 推荐成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时先将待测样品做一系列稀释，再取一

5、定量的稀释菌液接种到培养皿上，使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目， 即可换算出样品中的含菌数。说明：为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300 的平板上进行计数。将待测样品经一系列10 倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放入适宜的温度下培养计算菌落数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布、 培养计算出菌落平均数。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌

6、落数而不是活菌数来表示。涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50 个左右为最好。每克样品中的菌落数( C V) M，其中， C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL) ，M代表稀释倍数。二、测定土壤中的微生物数量土壤中生活的微生物种类和数量是极其丰富的，这些数量众多的微生物对提高土壤肥力有重要作用。因此，测定土壤的含菌量可以作为判定土壤肥力的一个重要指标。1实验原理平板菌落计数法是将待测定的微生物样品按比例作一系列稀释后，将其中的微生物充分分散成单个细胞，吸取一定量某几个稀释度的菌液接种到平

7、板上，培养一段时间后，每个单细胞生长繁殖形成单个菌落，根据稀释倍数、 取样接种量和菌落数即可换算出样品的含菌数。2材料用具土壤样品：尿素，酵母粉，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠、酚红、琼脂，1 mol/L NaOH 溶液，无菌吸管，盛有9 mL 无菌水的试管，盛有90 mL 无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶，试管架，无菌培养皿，记号笔，烧杯等。3方法步骤(1) 制备尿素固体培养基准确称取尿素20 g ，酵母粉0.1 g ，磷酸二氢钾9.1 g ，磷酸氢二钠9.5 g ，酚红 0.01g，琼脂 20 g ，依次加入盛有900 mL 蒸馏水的烧杯中，加热溶解后，用1 mol/L NaOH 溶液调 pH 至 7.

8、2 7.4 ，补加蒸馏水至1 000 mL 。(2) 制备土壤样品稀释液称取土样 10 g ，放入盛有90 mL 无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，振荡约20 min ，使土样和水充分混合，将土壤悬液制成10 1、 10 2、 10 3、 104 、105 、10 6 不同稀释度的稀3名校名 推荐释液。制备土壤样品稀释液时应注意每个吸管只能接触一个浓度的稀释液，且取样前需充分摇匀。(3) 加样取 10 套无菌培养皿，取10 4、 105 和 106 每种稀释度做 3 个重复平板，留下一个平板作空白对照。 分别用 1 mL无菌移液管精确吸取10 4、10 5、10 6 三个稀释度菌悬液各0.2 mL

9、，加至相应编号的无菌培养皿中( 如图 ) 。微生物数量测定的流程图(4) 倒平板将菌液移入培养皿后立即倒入溶化并冷却至45 左右的尿素培养基( 倒入量约15 mL)，随即快速晃动培养皿，使菌液和培养基充分混匀后平置，待凝。(5) 培养待平板完全凝固后，倒置于恒温箱中37 培养。(6) 统计菌落数培养 48 h 后取出平板，统计各皿中的菌落数，将结果记录在表格中，计算结果时，应选取每皿菌落数在30 300( 如图 ) 的一组平板为代表进行统计。每皿菌落数示意图(7) 计算样品中菌数的公式每克样品的菌数同一稀释度的菌落平均数 0.2 稀释度 10直接计数法统计菌数4名校名 推荐在探究培养液中酵母菌

10、种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。 计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由2516 400 个小室组成，容纳液体总体积为30.1 mm。某同学操作时将 1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。(1) 在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数， 并记录数据； 把酵母菌培养液放置在冰箱中； 第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。请纠正该同学实验操作中的3 处错误：。 _ _ 。(2) 在实验前应该对

11、计数板、吸管等器具进行_处理。(3) 如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是_ 。(4) 如果观察到如图所示 a、 b、 c、 d、 e 5 个大格共80 个小室内共有酵母菌48 个，则上述 1 mL 酵母菌样品中约有酵母菌 _个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？ _ 。【解析】对各小题逐项分析如下题号分析在从试管中吸取酵母菌之前，应将试管轻轻振荡几次，目的是使酵母菌在(1)培养液中均匀分布。 酵母菌的培养液应置于适宜条件下，并且每隔 24 小时就要统计一次菌落数目(2)为了避免杂菌污染，实验中所用吸管、计数板等器具需进行灭菌处理解答时要注意以下两点：统一单位；注

12、意体积的变化。400 个小室共(3)容纳液体总体积为 0.1 mm3，则 80 个小格容纳体积为： 210 2mm3，含酵(4)母菌 48 个，又因酵母菌培养液总体积为100 mL，统一单位后即可求出酵母菌个数【答案】(1) 应将试管轻轻振荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养5名校名 推荐应连续七天，每天观察、取样计数并记录数据(2) 灭菌 (3) 适当稀释(4)2.4 10 8多次计数，求平均值1上题中某同学用一支移液管连续三次取1 mL菌液进行稀释， ( 过程如图 ) 中间忘记冲洗移液管，计数结果将()A偏低B偏高C不变D无法判断【解析】由于移液管未冲洗，下

13、一次使用时会带有上次的高浓度菌液，使计数结果偏高。【答案】B土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(2016 四川高考) 图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。(1) 图中选择培养基应以 _为唯一氮源； 鉴别培养基还需添加 _作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_色。(2) 在 5 个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105 的土壤样品溶液0.1 mL ，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、 156、 462、 178 和 191。该 过 程 采 取 的 接 种 方 法 是 _ ， 每 克 土 壤 样 品 中 的

14、细 菌 数 量 为_10 8 个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较_。(3) 现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70 个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码( 终止密码有UAG、UGA和 UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为_，突变基因表达的蛋白含_个氨基酸。6名校名 推荐【 析】【精 精析】(1) 能 催化尿素水解 放出氨和二氧化碳，因此 培养基中 以尿素 唯一氮源。挑取 菌落接种到加有酚 指示 的 培养基中，培养一段 后，菌落周 的氨增加，pH 升高，酚 指示 将 。(2) 程采取的接种方法 稀 涂布平板法。 利用稀

15、 涂布平板 数法 菌 行 数 ， 菌落数在30 300 的平板， 因此平板上 出的 菌菌落平均数 (156 178191) 3 175 个。每克土壤 品中的 菌数 1750.1 10 51.75 10 8。血 胞 数板 数法能将死 胞 算在内，而稀 涂布平板 数法只能 数活 胞( 只有活 胞才能在平板上生 ) ，故一般血 胞 数板 数法要比稀 涂布平板 数法的 果大。(3) 箭 插入70 个核苷酸，箭 后密 子的解 方式 *AG，UGA，GAA 比3 种 止密 可 ，此 的 止密 UGA。从起始密 到 止密 之前共有 273 72 个碱基，因此突 基因表达的蛋白含115 个氨基酸。【答案】(1

16、) 尿素酚 红(2) 稀 涂布平板法1.75少(3)UGA115稀 平板 数法的 差分析(1) 稀 移液管不冲洗，偏大；(2) 平板中菌落数太多， ( 可能重复 ) 偏小；(3) 稀 未混合均匀，可能大可能小。2在做土壤中分解尿素的 菌的分离与 数 ，甲 用氮源只含尿素的培养基，乙 用氮源除含尿素外 含硝酸 的培养基，其他成分都相同， 在相同条件下操作、培养与 察， 乙 属于()A空白 照B 准 照C相互 照D条件 照【解析】本 甲 ，乙 照 ， 某种 理， 照 另一条件的 理， 条件 照。【答案】D7名校名 推荐1噬菌斑 ( 如图1) 是在长满细菌的培养基上，由一个噬菌体侵染细菌后不断裂解细

17、菌产生的一个不长细菌的透明小圆区，它是检测噬菌体数量的重要方法之一。现利用培养基培养并连续取样的方法，得到噬菌体在感染大肠杆菌后数量的变化曲线( 如图2) ，对该曲线的叙述正确的是()A曲线 a b 段噬菌体数量不变，说明噬菌体还没有开始侵染细菌B曲线 a b 段，细菌内正旺盛地进行细菌DNA的复制和有关蛋白质的合成C曲线 b c 段所对应的时间内噬菌体共繁殖了10 代D限制 c d 段噬菌斑数量增加的因素最可能是绝大部分细菌已经被裂解【解析】图中 a b 段噬菌斑已有一定数量，说明噬菌体已开始侵染细菌。b c 段噬菌斑增加了10 倍，说明噬菌体数约增加了10 倍，而噬菌体繁殖10 代，噬菌体

18、数目应增加到 210 倍。 c d 段噬菌斑数目增加减缓，很可能由于绝大多数宿主细菌细胞已被裂解。【答案】 D2菌种鉴定的重要依据是 ( ) A细菌的大小、形状和颜色B菌落的大小、形状、颜色C有无鞭毛D培养基的不同【解析】 不同种类的细菌所形成的菌落在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定特征，所以，每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为鉴定的重要依据。单个细菌用肉眼是看不见的，故细菌的个体特征不能作为菌种鉴定的依据。【答案】B3请选出进行土壤中细菌计数的正确的操作步骤()土壤取样称取 1 g 土壤放入盛有99 mL 无菌水的锥形瓶中吸取 0.5 mL 进行平板涂布依次稀释至

19、102、 103、 104、 105、 106 倍稀释度ABCD【解析】在分离土壤中某细菌时，应先选取土样(1 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。【答案】C8名校名 推荐学业达标测评 ( 三 )一、选择题1下列不属于统计菌数方法的是()A显微镜直接计数法B活菌计数法C稀释平板计数法D标志重捕法【解析】标志重捕法是统计动物种群密度的方法。【答案】D2测定土壤中细菌数量一般选用104、105 和 106 倍的稀释液进行平板培养；而测定真菌的数量一般选用102、 103 和 104 倍稀释，其原因是()A细菌个体小，真菌个体大B

20、细菌易稀释，真菌不易稀释C细菌在土壤中含量比真菌高D随机的，没有原因【解析】稀释的目的是使平板培养基上菌落数适中，便于计数。 细菌在土壤中含量比真菌高，故稀释倍数高。【答案】C3某同学在稀释倍数为106 的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是( 涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)()A2.34 10 8B2.34 10 9C 234D 23.4【解析】 平板上菌落的平均数稀释倍数每毫升样品中的菌落数，6即 2341010 2.34 10 9个。【答案】 B4下列关于“检测土壤中细菌总数”的实验操作的叙述中，不正确的是()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，

21、高温、高压灭菌后倒平板B取稀释倍数为104、 105、 106 的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL 涂布于不同的平板上C将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448 小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在300 个以上的平板进行计数【解析】本题以“检测土壤中细菌总数”实验为命题点。检测土壤中细菌总数时，要先用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、 高压灭菌后倒平板，然后取稀释倍数为104、105 、106 的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板9名校名 推荐倒置， 37 恒温培养24 48 小时，最后在确定对照组无菌后，为保证实验结果的准确性，应选择菌

22、落数在30 300 个的平板进行计数。【答案】D5下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是()A KH2PO4、Na2HPO4、 MgSO47H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水B KH2PO4、Na2HPO4、 MgSO47H2O、葡萄糖、琼脂、水C KH2PO4、Na2HPO4、 MgSO47H2O、尿素、琼脂、水D KH2PO4、Na2HPO4、 MgSO47H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水【解析】分解尿素的细菌除了加入尿素作为氮源外，还需要葡萄糖作为碳源和能源。【答案】A6在做分离分解尿素的细菌实验时，A 同学从对应106 培养基上筛选出大约150 个菌落，而其他同学只选择出大约50 个菌落。

23、A 同学的结果产生原因可能有()由于土样不同由于培养基污染由于操作失误没有设置对照实验ABCD【解析】导致 A 同学菌落数目过高的原因既可能是取样问题，也有可能是培养基被其他微生物污染，还有可能是实验操作出现失误。与设置对照实验与否无关。【答案】A7下列叙述错误的是()A因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离B测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同C只有得到了3 个或 3 个以上菌落数目在30 300 之间的平板，才说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数D牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，

24、说明选择培养基已筛选出一些菌落【解析】 如果涂布三个平板能够得到 2 个菌落数目在 30 300 之间的平板， 就说明稀释操作比较成功， 并能够进行菌落的计数。 计数的方法是舍弃相差很大的一个， 然后取平均值。【答案】C8某细菌培养至对数期，当细菌数目为105 个 /mL 时，开始计时，90 min后细菌数目为 1.6 10 6 个/mL。试问再经过多久，细菌数目会达到6.4 10 6 个/mL()10名校名 推荐A 30 minB 45 minC 60 minD 90 min【解析】按公式t0t1.6 1065t,t105个N N2，则 10 22 16， t 4。即细菌由690/mL1.6

25、 10个 /mL，共繁殖了4 代，每个繁殖周期为4 22.5 min。仍按此公式可知，由1.6 10 6 个/mL6.4 106 个 /mL，繁殖了2 代，共需222.5 45 min 。【答案】B二、非选择题9自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。(1) 步骤如下：制备稀释倍数为102、 103、 104、 105、 106 的系列稀释液。若对大肠杆菌进行计数，应选用_法接种样品。适宜温度下培养。(2) 结果分析测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106 的培养基中，得到以下几种统计结果

26、，与事实更加接近的是_。A一个平板，统计的菌落数是23B两个平板，统计的菌落数是22 和 26，取平均值24C三个平板，统计的菌落数分别是31、 9 和 32，取平均值24D四个平板，统计的菌落数分别是31、 32、 34 和 35，取平均值33一同学在稀释倍数为106 的培养基上测得平板上菌落数的平均值为23.4 ，那么每毫升样品中的菌株数是( 涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_ 。用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量_( 填“多”或“少” ) ，因为 _ 。【解析】(1) 若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释平板涂布法接种样品。(2) 应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。 23.4 0.2 10 61.17 10 8。因为菌落可能由1 个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。【答案】(1) 稀释平板涂布(2) D1.17 10 8多当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的是一个菌落10在现代农业中， 常在饲料中加入一定量的尿素去饲养牛等牲畜，因这类牲畜具有特殊的器官瘤胃，在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素为唯一氮源。某同学设计了如下实验，对能分解尿素的细菌进行分离和计数。取样：到屠宰场从刚宰杀的牛的瘤胃中取样，将样品装