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文档简介
1、植物中如何提取RNA,实验原理 RNA的提取:破坏细胞膜除去蛋白除去DNA除去盐离子。 RNase是一类生物活性极其稳定的酶类,能耐高温、耐酸、耐碱,高压灭菌处理也不能使其完全失活。在提取RNA实验中,要尽量抑制RNase的活性。 DEPC(焦磷酸二乙酯)是很强的RNase抑制剂,可以使RNase的活性丧失。实验中使用的 枪头、 EP管、溶液都要利用0.1%的DEPC处理,Tris不可以用DEPC处理。耐高温的玻璃器皿等要在250烘烤4小时以上。 内源的RNase一般利用蛋白质变性剂除去。如苯酚、氯仿、胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠等。 无水乙醇、高浓度的盐溶液和异丙醇中可以沉淀RNA或DNA,
2、前两者利于沉淀大片段的核酸。 注意:DEPC是一种具有致癌嫌疑的有机物!通常消毒的工作已由你购买试剂的公司完成,你只需买来用就好!,关键: 1、构建无RNA酶的操作环境 2、取样 取样品时,要用研钵。加入液氮,迅速研磨。由于液氮温度很低,用液氮来冷冻组织可以快速地达到低温,防止组织被破坏。此外,液氮可使组织液结冰,利于充分研磨。液氮干后马上再加入少量液氮,再研磨,反复3次。,无RNase条件的建立: 1、用70%酒精棉球清理试验台离心机等工作范围内。实验中所用工具需紫外光消毒。实验所需的枪头、EP管、研磨棒都需做消毒处理 2、带一次性口罩,手套,少说话,因为唾液中也含酶。(经常更换手套可避免R
3、NA酶污染),操作步骤,1、取已称重的植物嫩叶,液氮研磨,用1.5ml tube分装样品; .每管加入0.5ml Trizol液(裂解液),迅速混匀,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 、室温下静置510分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离 、加入0.5ml的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒(或用小型离心机)室温静置5分钟 、 12000r/min离心10分钟 6、取上清液(水相)转入新的离心管,加入等体积异丙醇,室温放置10分钟,12000r/min离心10分钟。 、弃去上清液,加入至少1ml的70%乙醇,混匀,4下12000r/min离心5分钟。 、用移液枪把液体吸出来,去上清液(注意:不要吸出沉淀),然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中,必要时可55-60水溶 10分钟。,检测,1、凝胶电泳检测 2、DNA的紫外分光光度计检测 OD260
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