生物化学课件：第20章常用分子生物学技术的原理及其应用

1、第21章,常用分子生物学技术的原理及其应用,主要内容,一、核酸分子杂交技术 二、PCR 三、核酸序列分析 四、基因文库 五、生物芯片技术 六、生物大分子相互作用研究技术 七、遗传修饰动物模型的建立和应用 八、疾病相关基因的克隆与鉴定,分子生物学研究策略,人类基因组计划,转录组研究,蛋白质组计划,第一节,分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着

2、一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链 (heteroduplex)。,一、分子杂交与印迹技术的原理,核酸分子杂交的应用,研究DNA分子中某一种基因的位置 鉴定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是Southern印迹、Northern印迹、斑点印迹以及基因芯片等核酸检测手段的基础。,（一）印迹技术,印迹技术（blot）是指将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程。 Southern在1975年将琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段在凝胶中进行变性使其成为单链，然后将硝酸纤维素（nitrocellulose，N

3、C）膜放在凝胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细管作用原理使凝胶中的DNA片段转移到NC膜上，使之成为固相化分子。载有DNA单链分子的NC膜就可以在杂交液中与另一种带有标记的DNA或RNA分子（即探针）进行杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称为“blot”，译为印迹技术。,核酸探针（probe）是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。 标记物：常用放射性核素、生物素或荧光染料。,（二）

4、探针技术,核 酸 探 针,基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 人工合成的寡核苷酸探针,探针的标记,放射性标记探针（32P、3H、35S） 优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染 非放射性标记探针 生物素(biotin)和地高辛 (digoxigenin),二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹 (Southern blot),（二）RNA印迹 (Northern blot),（三）蛋白质的印迹 (Western blot),用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,其他： 斑点印迹 (dot blo

5、tting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA芯片技术 (DNA chip) DNA微阵列 (DNA microarray),待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA样品的电泳分离 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜（印迹）： 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 Southern杂交（预杂交、杂交、洗膜） 杂交结果的检测,（一）DNA印迹,Southern blot的主要步骤,Southern blot,放射自显影照片,检测RNA（主要是mRNA） 与Southern blot不同： 靶核酸：RNA，无需进行限制性酶切酶消化 RNA电泳 电泳结束

6、后不需要变性 作用：检测某一组织或细胞中已知特异mRNA的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中同一基因的表达情况。,（二）RNA印迹 Northern blot,免疫印迹（immunoblot）又称蛋白质印迹（Western blot），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。 由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。,（三）蛋白质印迹 Western blot,主要步骤,蛋白质样品的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE)电泳 蛋白质的电转移 靶蛋白的免疫

7、学检测 靶蛋白与第一抗体（一抗）反应 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 显色反应：酶促反应,三种印迹技术的比较,斑点杂交,肺炎链球菌杂交结果,铜绿假单胞菌杂交结果,铜绿假单胞菌与肺炎 链球菌混合后杂交结果,多种细菌混合后杂交结果,组织、细胞或染色体的固定 包括： 基因组原位杂交技术 荧光原位杂交 原位PCR,原位杂交,荧光原位杂交 (Fluorescence in situ hybridization，FISH),原位杂交可检出被检基因的空间位置状况，即细胞的具体定位、数目及类型。,第二节,聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction,背 景,DNA复制,Prim

8、ase,DNA-pol,DNA-pol,DNA复制,背 景,发展简史,1993年,Mullis因发明PCR技术荣获诺贝尔化学奖!,发展简史,Company Logo,核酸体外扩增的设想,概 念,即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。,PCR（Polymerase Chain Reaction）,一、PCR技术的工作原理,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,PCR体系基本成分,利用特异性引物以cDN

9、A或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。,二、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 法医学的应用,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突变,二、PCR技术的主要用途,将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序

10、的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。,PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性 。,（四）DNA序列测定,（五）基因突变分析,二、PCR技术的主要用途,逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆转录PCR技术,三、几种重要的PCR衍生技术,原位PCR（in situ PCR）是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探

11、针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。,（二）原位PCR技术,（三）实时PCR技术,实时PCR（real-time PCR）技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。,Company Logo,实时PCR的基本原理,引入荧光标记分子，并使荧光信号强度与PCR产物量成正比，可对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，计算出PCR产物量。 根据动态变化数据，可以精确计算出样品中最初的含量差异。,实时定量PCR技术： 利用荧光信号

12、的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,荧光定量PCR,扩增曲线 荧光阈值 Ct值,荧光定量PCR常用名词概念,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,平台期,扩增曲线,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Baseline,Lgliner phase,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的1

13、0倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值,Threshold,荧光阈值,平台期,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct value,Ct值,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性,Ct值的重现性,Cycle number,Ck 104,Ck 102,Sample,Lg of DNA concentration,模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈

14、线性关系。,Ct值与模板起始量的关系,非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe,常用荧光标记方法,SYBR Green I染料法原理,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,热 变 性,引物退火,延伸反应,SYBR Green I 染料法作用机理,问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。,SYBR Green I染料法问题点与关键点,关键点： 设计合适

15、引物，防止非特异性扩增！,使用方便，不必设计复杂探针 具有价格优势,优 点,无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低,缺 点,SYBR Green I染料法优缺点,Taqman探针法原理,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,Taqman探针法工作机理,高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探

16、针,缺 点,Taqman探针法优缺点,分子信标探针,分子信标,高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低,优 点,只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高,缺 点,分子信标,Company Logo,第三节,核酸序列分析 Nucleic Acid Sequence Analysis,Company Logo,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法 (Maxam-Gillbert法),DNA链的末端合成终止法 (Sanger法),弗雷德里克桑格，英国生物化学家，曾经在1958年及1980年两度获得诺贝尔化学奖。,一、DNA链末端合成终止法,脱氧核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸分子结构

17、,原理及结果示意,Company Logo,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。 用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,二、DNA自动测序,DNA序列自动分析原理及结果图,第四节,基因文库 Gene Library,Company Logo,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library),基因文库(gene libr

18、ary),是指一个包含了某一生物体全部基因组DNA序列的克隆群体。,Company Logo,一、基因组DNA文库,基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。,用于构建基因组文库的载体有噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。以 噬菌体为载体的人基因组DNA文库的克隆数目至少应该在106个以上，方可认为该文库包含了99%的基因组DNA序列。,基因组文库和cDNA文库的构建和筛选,Company Logo,cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织

19、细胞的基因表达信息。 克隆数在106以上的cDNA片段才有可能包含来自于细胞内含量很低（低丰度）的mRNA的信息。,二、cDNA文库,Company Logo,第五节,生物芯片技术 Biological Chip Technique,生物芯片与DNA芯片的概念,生物芯片,信息芯片,DNA芯片,蛋白质芯片,组织芯片,功能芯片,生物样品制备芯片,核酸扩增芯片,微缩芯片,毛细管电泳芯片,最成熟！,指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。,一、基因芯片的概念,由

20、于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为基因芯片技术。,基因芯片技术的基本原理,核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理 大规模集成的固相杂交,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息,基因芯片的分类,原位合成芯片 （In situ synthetic GeneChip） Affymetrix公司,DNA微集阵列 （DNA microarray） 斯坦福大学 Patrick Brown研究小组,点阵制备方法的不同,

21、DNA微集阵列的制备,喷墨打印：非接触式,采用常规分子生物学技术如PCR、分子克隆、DNA合成技术等，预先合成DNA或基因片段，然后以显微打印的方式，将这些基因片段有序地固化于支持物表面制成。,针式打印：接触式,基因芯片工作流程示意图,Sample cells,Extract RNA or DNA 2) RT or PCR amplification 3) Fluorescent labeling,Reference cells,Sample ready,combine,Labeled RNA or DNA (Sample ),Labeled RNA or DNA (Reference),2)

22、,1),3),1),2),3),基因表达谱双色标记,1) hybridize,Apply sample,2) rinse,分子杂交,探针的量显著大于靶基因片段，杂交信号的强弱与样品中靶基因的量成正相关。,Hybridization,The labeled target is selectively bound to complementary probes Note: know the location of each probe on the array,Laser 1,Laser 2,Detector 1,Detector 2,芯片的扫描,检 测 分 析,图 像 处 理,Detector

23、1,Detector 2,False-color differential image,Company Logo,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质分子间的亲和反应：抗原-抗体、受体-配体,蛋白质芯片 (protein chip),蛋白质芯片作用原理,发展前景,（1）建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性； （2）改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。 （3）提高芯片制作的点阵速度；提供合

24、适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。 （4）研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。,Company Logo,第六节,The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,生物大分子相互作用研究技术,Company Logo,一、蛋白质分离纯化技术,（一）沉淀法 1. 盐析法 2. 等电点沉淀法 （二）电泳技术 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳 （三）层析技术,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,双向电泳,二维凝胶电泳 (two-dimen

25、sional gel electrophoresis，2-DE) 是目前蛋白质组研究中最有效的分离技术。 两向电泳： 第一向：以蛋白质电荷差异为基础进行分离的等电聚焦 凝胶电泳； 第二向：以蛋白质分子量差异为基础的SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳。,第一向：蛋白质等电点 第二向：蛋白质的分子量,双向电泳,Company Logo,一、蛋白质相互作用研究技术,酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选,常用蛋白质相互作用的研究技术：,Company Logo,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的

26、方法。,（一）标签蛋白(tagged protein)沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,标签融合蛋白沉淀实验流程示意图,（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途,Company Logo,酵母双杂交系统的应用,证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。,1.将待测基

27、因与Gal4蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒； 2.将诱饵质粒转化酵母细胞株中，选择被转化的酵母； 3.再将文库质粒转化到酵母中； 4.通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白。,酵母双杂交系统技术步骤,Company Logo,电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。,二、DNA-蛋白质相互作用分子分析

28、技术,（一）电泳迁移率变动测定,凝胶迁移实验结果示意图,Company Logo,染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。,（二）染色质免疫沉淀法,Company Logo,染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图,Company Logo,第七节,The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model,遗传修饰动物模型的建立及应用,Company Logo,转基因技术（Transgene technolo

29、gy） 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。 采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,一、转基因技术,受精卵原核显微注射法,Company Logo,转基因技术,在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。,绿色荧光蛋白兔子,绿色荧光蛋白：2008年度诺贝尔化学奖,绿色荧光蛋白被誉为“二十一世纪显微镜”，用紫外线一照就发出鲜艳的绿光，它可以帮助研究人员观

30、察先前肉眼无法看到的细胞体系工作过程，例如脑神经细胞的发展或者癌症细胞是如何扩散的。,核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,二、核转移技术,老鼠胚胎干细胞的核移植,克隆羊的诞生过程,Company Logo,1996年7月5日，世界上第一只克隆羊诞生。英国科学家伊恩威尔穆特领导的研究小组在苏格兰的罗斯林研究所培育出世界上第一只体细胞克隆羊“多利”，他因此被称为“克隆羊之父”。威尔穆特的杰出工作使“胚胎学研究发生了根本性的改变”。,Company Logo,基因剔除技术(gene knock out) 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。 建立在同源重组技术和胚胎干细胞基础上。,三、基因剔除技