合工大生化实验方案

1、不同植物样品可溶性蛋白含量和多肽组分的差异一实验目的与意义1.掌握冷冻离心机的操作使用方法。2.掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。3.掌握分光光度计的使用方法和原理。4.掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。5.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。二试剂与仪器试剂：Tris60g ，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5g ，-巯基乙醇2.5ml，蛋白酶抑止剂（PMSF 苯甲基磺酸氟）；100 g mL 牛血清白蛋白（125mg），考马斯亮蓝 G-250（500mg），90 乙醇（250mL），85 （ W V ）的磷酸（500mL）；Na2HPO412H2O（250g），NaH2PO42H2

2、O（50g），SDS（500mg），巯基乙醇（0.5ml），甘油（5ml），溴酚蓝（10mg），0.2mol/L pH磷酸盐缓冲液（3L），Acr（150g），Bis（10g）， TEMED（10ml），AP（50g），冰乙酸（350ml），甲醇（250ml），50%甲醇（2L），冰乙酸（200ml），仪器：研体，烧杯，玻璃棒，量筒（10ml），移液管，1000ml容量瓶,冰浴，离心机；分光光度计，烧杯，量筒，移液管，试管（8个），100mL容量瓶（2个），1000mL容量瓶（4个），棕色瓶，夹心式垂直板电泳槽（附带凝胶模1351001.5mm，1台/组），直流稳压电源（电压300600V，电

3、流50100mA），微量注射器（10或50L），大培养皿（120160mm 1个），棕色瓶（4个），三实验材料马铃薯 根 茎 叶四试验方法与操作过程不同植物样品可溶性蛋白的提取设备：研体，烧杯，玻璃棒，量筒（10ml），移液管，1000ml容量瓶,冰浴；试剂：1.提取缓冲液：（0.0125mol的Tris-Hcl，pH7.0），称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸馏水溶解，HCL调PH至7.0，定容至1000Ml.2. 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5g3. -巯基乙醇2.5ml4.蛋白酶抑止剂（PMSF 苯甲基磺酸氟）操作步骤：1.将买来的新鲜马铃薯整株清洗干净，分别剪取马铃薯的根 茎 叶。分

4、别准确称取3g植物材料于研钵中，加入10ml预冷的提取缓冲液（Tris缓冲液，Ph7.0），1g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.5ml的-巯基乙醇，可加入蛋白酶抑止剂（PMSF 苯甲基磺酸氟），置冰浴研磨匀浆，至20分钟。2、将研磨匀浆转移到塑料离心管并编号，提取液总体积10ml左右。先在4500r/min下离心20min，倾出上清液，并测定溶液体积，然后在10000rmin条件下离心10分钟，用吸管吸取上清液，至容量瓶中，定容至l00ml，并贴上标签。此即为植物不同样品中可溶性蛋白的提取液。可溶性蛋白含量的测定仪器：分光光度计，烧杯，量筒，移液管，试管（8个），100mL容量瓶，1000mL容

5、量瓶，棕色瓶，试剂：1 标准蛋白质溶液（ 100 g mL 牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白 25 mg ，加水溶解并定容至 100 mL ，吸取上述溶液 40 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL 即可。 2 考马斯亮蓝试剂：称取 100 mg 考马斯亮蓝 G-250 ，溶于 50 mL 90 乙醇中，加入 100 mL 85 （ W V ）的磷酸，再用蒸馏水定容到 1000 mL ，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。操作步骤1、标准曲线的绘制。取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置 5 min 左右，以 0 号试管为空白对照，利用分光光度计在 5

6、95 nm 下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2、样品测定分别从三种蛋白提取液中测定其中所含蛋白的含量，因此，分别吸取先前提取的可溶性蛋白提取液1ml，加入 5 mL 考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置 2 min 后在 595 nm 下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得每种提取液中的蛋白质含量。试管编号0123451mg/L标准蛋白溶液/ml蒸馏水考马斯亮蓝1.05.00.20.85.00.40.65.00.60.45.00.80.25.01.005.0标准蛋白浓度(ug/ml)020406080100A595nm聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白试剂1.连续体系SD

7、SPAGE有关试剂1）0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液：称 Na2HPO412H2O51.58g及NaH2PO42H2O8.74g，溶于重蒸水中并定容1L。2) 样品溶解液（上样液）：10ml/组01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油和0.02%溴酚蓝。用来溶解标准蛋白质及待测蛋白质样品。配制方法见表3-2：SDS巯基乙醇甘油溴酚蓝0.2mol/L pH磷酸盐缓冲液加重蒸水至最后总体积为100mg0.1ml1ml2mg0.5ml10ml表3-2 连续体系样品溶解液3) 凝胶贮液：称Acr30g，Bis0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色

8、瓶内，4贮存可用12个月。4) 凝胶缓冲液：6ml/组称SDS0.2g，加0.2mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4贮存，用前稍加温使SDS溶解。5) 1%TEMED：取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶内4贮存。6) 10%过硫酸铵（AP）：1ml/组称AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶内4贮存。7) 电极缓冲液（0.1%SDS，0.1mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液）：称SDS1克，加500ml0.2mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水定容至1L。8) 2%琼脂（糖）粉：20ml/组称琼脂（糖）2g，加100ml上述电极缓冲液，4贮存。固定液：取5

9、0%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。2. 脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1L仪器夹心式垂直板电泳槽（附带凝胶模1351001.5mm，1台/组），直流稳压电源（电压300600V，电流50100mA），微量注射器（10或50L），大培养皿（120160mm1/组），1000mL容量瓶（2个），棕色瓶（3个）操作步骤1、蛋白质样品的处理。分别取0.5ml植物可溶性蛋白提取液于试管中，并加入样品溶解液，1:1混合在一起，每种样品都编上号。2、凝胶及电泳仪的准备安装好电泳槽后，按附表表格配制浓度为7%的凝胶，配制好的凝胶迅速加入电泳槽的两块玻璃板的缝隙中，并插入梳子，等待凝

10、胶聚合20分钟。将制好的凝胶板夹在电泳槽上，向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳。3、加样。将微量进样器分别吸取之前制好的样品溶解液，按次序插入样槽下部慢慢进样。每槽点样10g。在另一个样槽中按同样方法加入标准蛋白质样品。4、电泳（不连续电泳）上槽接负极，下槽接正级，接通电源，当样品在浓缩胶时电压为80V，进入分离后电压调为120V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿为止。将电流、电压调至零后断电。5、凝胶板剥离电泳结束后，取下玻板，揭掉胶布，抽出夹条，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入固定液。6、凝胶的固定、染色和脱色将凝胶放入染色液中染色40分钟，然后用蒸馏水冲洗附着于胶面的染料，再将胶浸入脱色液中脱色，更换脱色液几次，直到背景清晰为止 将脱过色的凝胶照像作为实验报告的凭证。绘制电泳分离示意图，比较分析找到有差异的蛋白条带，