第五章 非切片法的制作.ppt

1、第五章 非切片法的制作,第一节 整体制片法 第二节 涂片法* 第三节 分离法 第四节 铺片法 第五节 滴片法* 第六节 压片法,染色：甲基绿、碘液、1%美兰,第一节 整体制片法,二、半永久和永久性制片,一、临时制片,第五章,1. 甘油封片法,怕压、易碎标本：,2. 甘油胶封片法,避免蒸发或流动：,最适合于柔软易碎材料。,石蜡或漆封边,第一节 整体制片法,第五章,3. 甘油或甘油胶-树胶双封片法,材料要观察的面朝向大盖片,载玻片,盖玻片的小片朝下封于载片上,第五章,第一节 整体制片法,甘油或甘油胶封片,中性树胶封片,4. 聚乙烯醇封片法,吸虫,新鲜和固定的标本,小而透明的标本用木素粉红或酸性品红

2、染色,乳酸和石炭酸等量混合剂配4%、5%、10%,甲壳动物、单殖吸虫、寄生线虫、棘头虫 及动物中粘孢子,单殖吸虫,猪带绦虫,棘头虫,第五章,第一节 整体制片法,30%Alc40%Alc50%Alc60%Alc70%Alc 80%Alc95 % Alc100%Alc100%Alc 纯酒精/二甲苯2：11：11：2纯二甲苯,（1）原生动物(或小型浮游生物)整体封片法,材料特点：在液体培养基中培养或制备成的悬液,弃培养液,各级酒精脱水、二甲苯透明,封片,弃上清液,第一节 整体制片法,第五章,5. 树胶封片法,离心机的转速,纽虫,华枝睾吸虫,材料特点：身体扁平如叶片状，固定时易卷缩,用薄荷冰/水合氯醛

3、于7%生理盐水麻醉,(2) 吸虫整体封片,第五章,第一节 整体制片法,70%Alc,第五章,第一节 整体制片法,(3)琼脂定位，薮枝虫(或水螅体、卵胚)整体封片,水螅,材料特点：易收缩、需要定位,聚缩虫,薄荷冰麻醉,第一节,薮枝虫,第五章,第一节 整体制片法,第二节 涂片法,将一些不需切片的动植物的组织细胞或体液组织（如动物的血液、精液、骨髓等）用机械的方法使其均匀地摊在载片上，再进行固定、染色、观察。,对玻片要求严格,洗液,流水冲至中性,Smear,第五章,一、人血液涂片,Blood Smear,2. 涂片方法：,1. 取血：,第二节 涂片法,第五章,注意： 滴血后马上涂片 推片速度、角度大

4、小与血膜厚薄有关 一张载片只能涂1次 用来推片的载片一边只能用1次,（1） Wright 染色法,（2） Giemsa染色法,瑞氏粉含曙红和亚甲蓝,吉氏粉含曙红和天青,对酸碱敏感！ 天青加热会消失！,第二节 涂片法,第五章,3. 染色,示血涂片不同部位的染色效果,人血涂片染色结果,蟾蜍血,鸟血,鱼血,抗凝剂,第二节 涂片法,第五章,二、对虾血淋巴涂片,1、血淋巴的采集,采血部位的选择：,心脏或血窦,一次性大量采血或做某些理化性质分析时从心脏取血。,要保持虾的活性 从血窦取血。,据对虾体长选 79号注射头,第二节 涂片法,第五章,二、对虾血淋巴涂片,注意： 血窦采血的部位应一致 血窦采血，采血量

5、不能过大 大量采血时，在第1次抽血后停1min，再抽1次。,中国对虾血涂片，Giemsa染色,第二节,第二节 涂片法,第五章,三、贝类血淋巴涂片（补充）,1、血淋巴的采集：闭壳肌,注射器中加抗凝剂或固定液,第二节,Wright-Giemsa染色,酶染色,密度梯度分离,流式细胞仪分类血细胞,第二节 涂片法,第五章,第二节 涂片法,第五章,四、刺参体腔液（体腔细胞）涂片（补充）,体腔液的采集：,从身体腹面或右侧用注射器抽取体腔液,注射器（25号针头）中吸入等体积抗凝剂或固定液,EM固定液， EDTA LMO固定液（6106 mol/L EDTA, 0.01mol/L PBS, ASW, pH6.0

6、0）。 柠檬酸钠：3.8 mgmL 肝素钠：0.2-0.6 mgmL 草酸钠：1.0-1.5 mgmL,刺参体腔细胞,五、细菌涂片（补充）,第二节 涂片法,第五章,涂片方法：,第二节 涂片法,第五章,第五章,第二节 涂片法,第三节 分离法（自学）,借药物的作用，使组织软化、组织各组成部分之间的某些结合物质溶解，或用机械的方法，将组织的各个组成部分分离，并使其摊开于玻片上，制成临时或永久性封片。,如：肌肉纤维或神经纤维分离,第五章,第四节 铺片法 （自学）Spread,如：皮下结缔组织制片法,第五章,活体染色和铺片,C.T.铺片，Verhoeff Van Gieson, Toluidine Bl

7、ue,第五节 滴片法,以滴片法制作鱼类或贝类等的染色体标本 。,细胞分裂前期,细胞分裂中期,细胞分裂后期,第五章,第五节 滴片法,第五章,原理： 外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如在培养液中加入植物血凝素（PHA），小淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。短期培养后，经秋水仙素处理，低渗和固定，即可得到大量的有丝分裂细胞。,第五节 滴片法,第五章,染色体制片材料的选择：,分裂程度高,细胞易于分散,含较少的间质和其它嗜碱性物质,染色体标本制备程序：,一、鱼类染色体标本的制备,第五节 滴片法,第五章,胚胎(卵裂期或原肠期)，上皮细胞，鳃细胞，肾（头

8、肾)细胞,1、材料选择：,注射部位,杀死鱼前810h或1618h, PHA(810g/g鱼体重)或酵母液(0.20.5ml/100g鱼体重),杀死鱼前45h，秋水仙素 (35g/g鱼体重),取头肾 ,制备细胞悬液,0.075mol/L KCl， 低渗,加固定液静置2030min，重复2-3次,冷滴片,Giemsa染色,第五节 滴片法,第五章,第五节 滴片法,第五章,二、贝类染色体的制作,材料选择： 卵胚、幼体（囊胚期 担轮幼虫期）、鳃、生殖细胞,（48细胞期卵胚）,4细胞出现后1025min，每隔5min处理1批 （0.030.04%秋水仙素，30min）,固定：1：1醋酸甲醇，1：3醋酸甲醇

9、,热滴片,皱纹盘鲍,7%MgSO4或MgCl2麻醉后取鳃,活体解剖取鳃,50%海水配制的0.04%秋水仙素，30min,低渗: 25%海水，30min,固定：carnoy氏液,将鳃放入50%冰醋酸解离，细胞浓度（50150）104个/ml,热滴片,Giemsa染色,三、对虾染色体制片,第五节 滴片法,第五章,材料选择: 胚胎和幼体；幼虾和成虾时期选精巢、中肠、触角腺或鳃,原肠期至肢芽期胚胎,无节幼体,0.02%秋水仙素（海水配),雄虾注射秋水仙素（1.5g/g虾体重), 4-6h后取精巢,低渗,固定,滴片,50%醋酸解离,材料：主要选择分裂旺盛期的组织如：棘皮动物的胚胎、幼虫、成体的鳃、性腺等，海参采用后期幼虫、耳状幼虫、成体呼吸树组织等,四、棘皮动物染色体标本的制备（补充）,棘皮动物受精卵的受精膜在海水中钙化后非常有韧性,且很难除去,作业：自己查资料完善制备过程,第五节 滴片法,第五章,5. 滴片悬液的细胞浓度,总结： 影响染色体标本制