分子生物学实验课：转染及报告基因检测2015

1、脂质体转染实验与荧光素酶活性检测,目的,主要学习利用报告基因来研究基因的转录调控。 了解转染过程。 学习荧光素酶报告基因的检测方法。,报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及检测方便且适合大规模检测。,什么是报告基因？,所谓的报告基因（reporter gene）,是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。该基因的表达与插入基因的表达有关。 该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及检测方便且适合大规模检测。,理想的报告基因,内源性低,细胞内其它的基因产物 不会干扰报告基因的

2、检测,报告基因编码产物的检测应该 快速、简便、灵敏度高并且重复性好,Reporter,荧光素酶报告基因载体,常用的萤光素酶报告基因载体： 萤火虫萤光素酶报告基因载体 海肾萤光素酶报告基因载体 pGL2 , pGL3 , pGL4 萤火虫荧光素酶报告基因：萤火虫luc以其高度的灵敏性和很宽的线性范围而成为哺乳动物细胞中使用最多的报告基因。 本次所用载体： promega公司的pGL3-promoter 所用质粒： pGL3-promoter-ERE(雌激素应答元件）,与配体结合的ER发生构型改变，被激活形成二聚体，激活的ER二聚体与雌激素应答元件(estrogen response elemen

3、t, ERE)结合， ER- ERE复合物促使转录起始复合物形成并诱导转录。,E-box,E-box,A gene,full-luc ddebox-luc,荧光素酶报告基因简单实验流程：,1、构建载体把调控序列连入到含有萤火虫 萤光素酶（luc）或海肾萤光素酶（Rluc） 的载体中 2、转染 3、提供刺激 4、检测荧光,报告基因载体,报告基因检测试剂,转染原理,脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的。在水中可以自动生成闭合的双层膜，最初 ,人们只是运用脂质体模拟生物膜 ,研究膜的构造及功能 ,从而发现了膜的融合及内吞作用 ,因而可用作外源物质进入细胞的载体。 现商品化的脂质体通常都是阳离

4、子脂类和中性脂类的复合体。其中以阳离子脂类起主要作用，阳离子脂质体既能与DNA可以通过静电作用形成脂DNA复合物，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附。从而引导DNA进入细胞。中性脂类可促胞内释放DNA。,（一）转染步骤： 1.培养好的MCF-7细胞接种细胞孔板，37的CO2培养箱培养，待细胞密度为5080%，约24h后取出细胞孔板，每孔加入250ul无血清培养基，待用。（共4孔，每孔转染相同质粒） 2.待转染质粒ERE(雌激素应答元件质粒)、ER（雌激素受体质粒）、SV40(海肾荧光素酶）与脂质体混合物制备（下列数据均为每孔加入量）： a. 取1.5ml离心管，加入无血清DMEM培养25L /孔，

5、然后加入ER和ERE质粒各0.2ug/孔，SV40质粒0.004ug/孔。 b另取1.5ml离心管，加入无血清DMEM培养25L /孔， 再加入1l Lipofectamine 2000，吹打混匀，静置5分钟。 c将稀释好的质粒和稀释好的Lipofectamine 2000混合，吹打混匀，静置20分钟，按每孔50l加入培养板的孔内，摇匀。(该混合液在20min6h内稳定)。 3.37的CO2培养箱培养, 6小时后，更换含10%胎牛血清培养基。,（二）加刺激 质粒转染6小时后加入TAM(他莫昔芬)刺激过夜，TAM刺激浓度为10nM(原始浓度100uM) 实验设2组：实验一组即空白组（加DMSO

6、2.5L）、实验二组（每孔加10uM TAM 2.5L）,每组设置两个平行孔。 (三）单光子测定,（一）转染步骤： 1.培养好的L2细胞接种细胞孔板，37的CO2培养箱培养，待细胞密度为5080%，约24h后取出细胞孔板，每孔加入250ul无血清培养基，待用。（共4孔，其中2孔转full-luc，另2孔转ddebox-luc） 2.待转染质粒full-luc 或ddebox-luc 、SV40(海肾荧光素酶）与脂质体混合物制备（下列数据均为每孔加入量）： a. 取1.5ml离心管，加入无血清DMEM培养25L /孔，然后加入full-luc或ddebox-luc质粒0.2ug/孔，SV40质粒

7、0.004ug /孔。 b另取1.5ml离心管，加入无血清DMEM培养25L /孔，再加入1l Lipofectamine 2000，吹打混匀，静置5分钟。 c将稀释好的质粒和稀释好的Lipofectamine 2000混合，吹打混匀，静置20分钟，按每孔50l加入培养板的孔内，摇匀。(该混合液在20min6h内稳定)。 3.37的CO2培养箱培养, 6小时后，更换含10%胎牛血清培养基。继续培养24小时。 （二）单光子测定,萤光素酶报告基因技术检测原理,Luciferase Luciferin + ATP 02,Light,荧光素酶活性检测,1.刺激后24h，细胞用PBS洗涤23次 2.取出荧光素酶分析试剂盒的所有试剂置于冰上避光溶解。 3.在24孔培养板的每个孔里加入100l 1溶解缓冲液(Reporter Lysis 1Buffer)/ 孔混匀，将培养板放入水平摇床上