硝酸纤维素膜质地较脆.ppt

1、生物技术综合实验 Comprehensive experiments of biotechnology,主要内容 Contents： 一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization Southern,Northern and Western

2、Blot 六、基因文库和cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达 Heterogenic Gene Cloning and Expression 八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein,核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。 杂交是指亲源关系相近的不同来源的DNA单链或DNA单链与RNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程。 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基

3、互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。,Part 5 分子杂交 Molecular Hybridization (DNA,RNA 非特异性地吸附蛋白质的作用较弱，因此特别适合于那些涉及蛋白质作用(如抗体和酶等)的非放射性标记探针的杂交体系。,因为硝酸纤维素膜是依靠疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜的进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素膜，特别是高温情况下，从而使杂交效率下降。因此不太适宜于在同一膜上重复进行杂交。再者，硝酸纤维素膜质地较脆，特别是经烘烤后，操作不方便，须特别小心。,缺点：,(2)尼龙膜(nylonmembrane)： 尼龙膜是目前较理想的一种

4、核酸固相支持物，它有多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经特殊处理，有些则是经过了正电荷基团的修饰。这种修饰的尼龙膜结合核酸的能力更强。,结合核酸的能力强，对于小分子量DNA片段(特别是200bp的DNA片段)现在更多的人倾向于使用尼龙膜。 尼龙膜可重复用于杂交，一次杂交后，探针分子可经碱变性而被洗脱下来，从而可用于与第二探针进行杂交。 缺点：杂交信号本底较高，可以用加大预杂交液中的非特异性封闭试剂的方法克服。,优点：,(3)化学活化膜(chemical activated paper)：将滤纸用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜(如ABM和APT纤维素膜)。,优点：DNA与膜共价结合

5、，因此反复多次使用不会有太多的损耗；对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力，这是硝酸纤维素膜及尼龙膜都不具备的。 但其结合能力一般较硝酸纤维素膜要低，活化过程较复杂，因此较少为人们所使用。,1.2 印迹方法,印迹的方法有多种： 可直接将核酸样品点样于固相支持物上，称为斑点或狭缝印迹法； 利用毛细管虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上； 利用电场作用的电转法； 利用真空抽滤作用的真空转移法。,Southern印迹法是指将电泳分离的DNA从凝胶中转移到固相支持物上的过程。 Northern印迹法则是指将电泳分离的RNA 从凝胶中转移到固相支持物上的过程。,根据待检测的核酸类型不同，

6、分为Southern印迹法和Northern印迹法。,1.3 固-液相杂交技术,在固相杂交中，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以比较常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。,1.3 固-液相杂交技术,（2）杂交体系的建立,（1）基本原理,双链DNA在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)变性，具有一定同源性的两条核酸单链可按碱基互补原则退火复性形成双链的过程。,（1）离子强度：一般杂交体系中离子强度为5或6SSC(1xSSC为0.15mol/L NaCI和0.0

7、15mol/L 柠檬酸钠)。 （2）DNA浓度：DNA浓度愈高，复性速度愈快。为保证足够的DNA浓度，除应加入足够的DNA量外，还应尽量减少杂交体积，一般以每平方厘米滤膜面积加50-100l杂交液为宜。,建立杂交体系应考虑到以下几个因素：,（3）DNA探针的长度：探针片段越大，其扩散的速度越慢，因此复性的速度越慢。 （4）温度：选择适当的杂交和洗膜温度是核酸分子杂交成败最关键的因素之一。通常杂交反应在低于Tm值15-25温度下进行。Tm值除受(G+C)含量影响外，还与杂交体系中离子的强度，探针的复杂性(长度)、是否含甲酰胺及错配率等多种因素影响。准确确定Tm值是比较困难的，也无必要。,Tm=8

8、1.5+16.6lgM+0.4l(G+C)-500/n-0.61(甲酰胺) 其中M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性（没有重复序列时，复杂性即为探针的长度，单位为bp）。,以下经验公式对于帮助判断Tm值很有用处：,预杂交 杂交 洗膜 杂交信号检测,（3）操作步骤,放射自显影：利用放射线在X线片上的成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。,1.4 液相杂交技术 液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型，由于液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高，所以不如固相杂交那样普遍。,1.5 原位杂交技术,（一）固相膜核酸分子杂交方法。,固相核酸杂交多是在膜上进行，因此，以下主要介绍固相

9、膜的核酸分子杂交方法。 1DNA的变性解链是杂交成功的关键,Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/LNaCl和0.5mol/L NaOH中1小时，然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl（pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小时。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。碱变性可避免DNA的降解.,2.变性DNA的转膜,变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定。硝酸纤维素滤膜（孔径0.45um）先在蒸馏水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min2h，凉干，DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥4h，然后再在

10、80真空干燥2h。,3预杂交。湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml预热至60的预杂交液（6SSC，0.5%SDS，5Denhardt液，100g/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至10g/ml，用前放100水溶液中煮沸变性10min，冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽，用封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68水浴中保温3-12h，当预杂交液温度升至68时，在滤膜表面常会形成水气泡，轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。,4杂交。 从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂

11、交液，用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好足量的液体保持滤膜湿润（50l/cm2）。溶液的组成是6SSC，0.01mol/L EDTA，变性的标记核酸探针，5Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口。杂交反应在68水浴中进行，所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定，一般为4-20 h。,5洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有2SSC和0.5% SDS溶液的盘中,室温下漂洗5min,再将滤膜移入2SSC和0.1% SDS中,室温下洗涤15分钟(轻轻摇动),然后将滤膜移入0.1%SSC和0.

12、5%SDS溶液中,68轻轻摇动保温2h，更换缓冲液后继续保温30min。 洗脱的温度一般应控制在Tm值12以下，Tm=69.3+0.41(G+C)%，双链DNA的Tm值随错配碱基对数每增加1%而递减1。,6结果显示。放射性测定方法，固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式，一是放射自显影法、另一是液闪计数法，放射自显影法比较简单，只需将杂交膜与X光片在暗盒中暴光数小时至数天，再显影，定影即可。对于杂交信号较强的固相膜，用一块增敏屏可显著增强暴光强度。此外，为了减弱32P的放射，暴光通常在-20或- 80下进行。,(二)固相核酸分子杂交类型,1菌落原位杂交（colony in situ hybrid

13、ization）。 是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。,实验步骤如下： 将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。 培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。 在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体，将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上，菌落面在上，注意防止滤膜底面存有气泡。 5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNa

14、Cl）浸湿的滤纸上，放置10min。 将滤膜转至中和溶液（1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl pH8.0)浸湿的滤纸上，放置10min，重复中和一次。 将滤膜移至用2SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min，SSPE配成20贮备液：3.6mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。 将滤膜用滤纸吸干，80真空烘干2h。,2斑点杂交（Dot blot）,是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manif

15、old），如Minifold和、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。,（1）DNA斑点杂交： 先将膜在水中浸湿，再放到15SSC中。 将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每 个样品一般点5l(210g DNA)。 将膜烘干，密封保存备用。 （2）RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10g总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5lDEPC水，加5l甲醛

16、/SSC缓冲液（10SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8l点样于处理好的滤膜上，烘干。 （3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。,3. Southern印迹杂交（Southern blot）,Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位

17、置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,（1）琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消解片段（0.325kb）分离开，分离大分子DNA片段（800-12000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%），分离小分子片段（5001000bp）用高浓度琼脂糖（1.0%），300-5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶。 电泳时，同时将分子量标记物加到旁边孔中，便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜，电泳完毕，

18、将胶浸到含0.5g/mlEB的TBE缓冲液中染色30min，也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在灌胶前加入胶片中，在254nm短波透射灯下拍照，加橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈f4.5，曝光20-40s。,（2）硝酸纤维素膜吸印。 1将胶片切成合适大小，切去右上角作为记号。 2将胶片放进盛有变性缓冲液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH）的盘中轻晃15min。 3换到中和缓冲液（1mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盘中轻晃30min。 4裁一张硝酸纤维素膜、2-4张3mm滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤

19、维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。先将硝酸纤维素膜浸到水中，再放入10SSC缓冲液,接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴手套操作。,5平盘上放一块比胶大的平板上面铺一张3mm滤纸,起灯蕊作用,盘中加入少量10SSC缓冲液（2.5cm厚），不能没过平板，使3mm滤纸充分饱和。 6将胶倒扣在3mm滤纸上。 7浸湿的硝酸纤维素膜在胶上，对齐。铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。 8膜上放一张3mm滤纸，不能与胶接触。 9上面加吸印纸及重物（500g左右）。,10通过滤纸的灯芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将DNA吸印到膜上，及时更换浸

20、湿的吸印纸，在室温下转印过夜。 11清除上面的东西。用镊子将膜取出，在6SSC中洗一下。 12自然干燥，80烤2h。 13这是的膜就可进行杂交，或室温密封保存。,Southern Blotting,1 DNA isolation and purification,2 DNA digested by Restriction enzyme,3 Gel electrophoresis of fragments,4 Transfer to membrane,5 prehybridization,6 Hybridization with radioactive probe,7 DNA fragments

21、 are visible after autoradiography or chemiluminescence,4Northern印迹杂交（Northern blot）,这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因

22、为它会水解RNA的2-羟基基团。,RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5g/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂

23、糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。,RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。,试剂： 10MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/LEDTA pH8.0。 5载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。 甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。 20SSC； 去离子甲酰胺； 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)； 0.1mol/L Tris，pH

24、7.5。,步骤： 140ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60，加7ml 10MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。 2等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1MSE缓冲液的电泳槽。 3使RNA变性（最多20g），RNA4.5l,10MSE缓冲液2l ，甲醛3.5 l ，去离子甲酰胺10 l 。 455加热15min，冰浴冷却。 5加2ml5载样缓冲液。 6上样、同时加RNA标记物。 760伏电泳过夜。,8取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。 9室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转

25、印。 10室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。 1120SSC洗胶1h。 1220SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。 13取出硝酸纤维素膜，80真空烘烤2h。,RNA extraction and isolation,5 10g isolated RNA 260/280nm 2.0(c.f. DNA 1.8),Northern Blotting,Denaturing agarose gel electrophoresis甲醛 Formaldehyde 0.66M/2.2mM乙二醛 Glyoxal /氢氧化甲基汞Methyl Mercuric

26、Hydroxide,Heat in formamide to denature,Blot/transfer the RNA onto a membrane using salt solution,RNA transferred to nylon or nitrocellulose membrane/filter,Probe can be radiolabelled or chemiluminescent. Random priming is the usual method for generating a labelled probe,Hybridization buffer is impo

27、rtant as is stringency of washing (Rapid Hyb 1hr),Northern Blotting,Northern Blotting,Probe can be washed off the membrane which can be reprobed or multi-probed.Use a housekeeping type to probe to analyse changes Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH三磷酸甘油醛脱氢酶), -actin, 2-microglobulin,5组织原

28、位杂交（in situ hybridization）,简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落原位杂交不同，菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交，而原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，对致密染色体DNA的原位杂交可用于显示按规定序列的位置，对分裂期间核DNA的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布；与细胞RNA的杂交可精确分析任何一种RNA在细胞中和组织中的分布。用来检测组织、细胞或染色体上的特殊DNA序列或mRNA的表达水平。,用来检测组织、

29、细胞或染色体上的特殊DNA序列或mRNA的表达水平。最初是使用带放射性的DNA或RNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置,用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。通常探针操作的长度以100-400nt为宜，过长则杂交率减低。最近研究结果表明，寡核苷酸探针（16-30 nt）能自由出入细菌和组织细胞壁，杂交效率明显高于长探针，因此，寡核苷酸探针和不对称PCR标记的小DNA探针或体外转录标记的RNA探针是组织原位杂交优选探针。 探针的标记物可以是放射性同位素，也可以

30、是非放射性生物素和半抗原等，放射性同位素中，3H和35S最为常用，3H标记的探针半衰期长，成像分辨率高，便于定位，缺点是能量低， 35S标记探针活性较高，影像分辨率也较好，而32P能量过高，致使产生的影像模糊，不利于确定杂交位点。,原位杂交中，标本的固定条件是影响杂交效率的重要因素。标本组织蛋白质的消化程度对探针进入细胞极为重要，去除蛋白质的方法是，用0.2mol/L HCl处理载玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同浓度的乙醇脱水。原位杂交还是一种新技术，发展很快，在敏感性、特异性、稳定性上还需进一步完善和提高。,6 Western Blot,1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到

31、硝酸纤维素（NC)或聚偏氟乙烯膜（PVDF)膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体（一抗）进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体（二抗），反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。,2 操作过程,SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影,Hours 0 4 8 16,Western blot analysis of the cleavage of Ca

32、spase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control,0h 4h 8h 16h,Western Blot analysis of cytochrome C release.,Cytochrome c release from mito