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![细胞免疫荧光实验步骤_第2页](http://file1.renrendoc.com/fileroot_temp2/2020-9/24/111452a2-3bd0-4f8a-8b4b-94f83b44f941/111452a2-3bd0-4f8a-8b4b-94f83b44f9412.gif)
![细胞免疫荧光实验步骤_第3页](http://file1.renrendoc.com/fileroot_temp2/2020-9/24/111452a2-3bd0-4f8a-8b4b-94f83b44f941/111452a2-3bd0-4f8a-8b4b-94f83b44f9413.gif)
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文档简介
1、细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天:1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min;2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次3min;3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);4. PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30min;5. 吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4孵育过夜;第二天:6. 加荧光二抗: PBST 浸洗爬片3次,每次3min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20
2、-37孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min;注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。7. 复染核:滴加DAPI避光孵育5min,对标本进行染核,PBST 5min4次洗去多余的DAPI;8. 用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。细胞免疫荧光步骤1.在24孔板里加500微升培养基,放爬片,接种细胞(做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右2.给药处理24h。3.PBS洗三遍。4.4冷的多聚甲醛固定15分钟,PBS洗三遍,每次5min,摇床。(避光)5.0.5TritonX100(PBS配)破膜15mi
3、n,PBS洗三遍,每次5min,摇床。6.5%BSA(牛血清白蛋白,PBS配)封闭60分钟,不用洗。7.加一抗孵育(5%BSA配),4摇床过夜。8.收集一抗,PBS洗三遍,每次5min,摇床。孵育二抗AlexaFluor488(1:1000),室温60min(避光)9. 回收二抗,PBS洗三遍,摇床,每次5min。10. 0.5ug/mLDAPI(5%BSA配,2滴/ml)染核15min。(避光)11.PBS洗三遍,每次5min,摇床。12.取载玻片,滴加10uL抗荧光衰减封片剂,将爬片有细胞面盖在封片剂上,指甲油封片子的对角线。Allstepsfor IF 1)Removecultureme
4、diumandfixcells(acommonfixativeis4%formaldehydeinPBS,for15minutes)2)WashwellinPBS(3x5minutesistypical)3)Permeabilizethecells(acommonpermeabilizationreagentis0.2%TritonX-100inPBSfor30minutes)4)WashwellinPBS5)(optional:Blockfornon-specificdyebindingusingtheImage-iTFXImageEnhancerSolution,I36933)6)Bloc
5、kfornon-specificantibodybinding30-60minutes(acommonblockingsolutionwouldbe3-6%bovineserumalbumin/5%normalgoatserum/PBS,orcommercialblockingreagentslikeourBlockAid,productB10710)7)Incubateinprimaryantibodyfor30-60minutes,inblockingsolutionorovernightat4degrees(antibodyconcentrationsvary,butusuallybetween0.5-10ug/mL)8)WashwellinPBS9)Incubateinsecondaryantibodyfor30-60minutes,in3-6%bovineserumalbumin/PBS(agoodstartingantibodyconcentrationis5ug/mL)10)WashwellinPBS11)Counterstainasneeded(suchaswithDAPI,D1306)12)Mountinappropriatemountingmedium(forfluore
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