肾脏病学实验技术操作规程_12860032_W

1、j ，s ，？7 5。，七 5 么 ，嘈畸 m- T e.c. h n i q u eerating P! ocedLJre ofE?n t.a,lTheExp、r-_i 归正一严仁 N ep h ro lo g yO;邕罩 肾脏病学实验技术操作规程 The Experimental TechniqueOperating Procedure of Nephrology主编陈香美 副主编吴镐师锁柱冯哲傅博 编 者（以姓氏笔画为序） 口丁瑞王远大王建中尹忠卢钊宇 白雪源口杨 朱呤玉孙雪峰李平李作祥李清刚 张冬张利张五星张雪光林淑苀胡婕侯判 洪权梅艳崔少远谢院生蔡广研 多 人队了精 PEOPLE S

2、 M I LITAR Y MEDICAL PRESS北京 图书在版编目 (CLP) 数据 肾脏病 学实 验 技术操作规程 陈香美 主 编 北京 ：人 民军医 ， 2011. 2 ISBN 978- 7- 5091- 4654- 5I . D肾 . n. 陈. m. D肾 疾病 实 验 技术操作规程IV. DR692 - 33中国 版本图 书馆 CIP 数据核字 (2011) 第 009231号 策划编辑：程晓 红 文字编辗郁静责任审读周晓洲出版人石 虹 出版发行人民军医 经 销 新华 书店通信地址 北京市 100036信箱 188 分箱邮 编 100036 质量反馈电话 (010) 51927

3、290, (010) 51927283邮购电话 (010) 51927252策划编辗电话 (010) 51927300-8718网址： www.pmmp. com.en印刷：潮 河 印业有限公司装订 恒兴 印装有限公司开本： 78 7 mm x 1092 mm 1/16印张 16字数 379 千字 版 印次： 20 11 年 2 月第 l 版第 1 次印刷印数： 0001 - 2.500定 价 106. 00 元 版权所有侵权必究 购买本社图书，凡有缺、倒、脱页者，本社负责调换 内容提要 本书全面、系统地介绍了肾脏病学研究领域中涉及的实验技术， 旨在为肾脏病专业的同仁提供一个简明、全面、高效的

4、实验技术流程。 全书分 8 章，第 1 章重点介绍了肾脏各种固有细胞的分离及培养方法， 包括常用的商品化细胞系。介绍了常用的基因转染方法以及激光共聚焦检测和流式细胞仪的最新应用。第 2 章主要介绍了常用的分子生物学技术， 专门分析了常见的实验失败原因并提出对策。第 3 章主要介绍了常用的肾脏常规病理、免疫病理、分子病理及电镜技术。第 4 章简要介绍了转基因及基因敲除动物模型的制备。第 5 章介绍了常用的肾脏疾病动物模型以及高难度大鼠肾脏发育、肾移植模型等的建立。第 6 章简单介绍了电生理技术。第 7 章为尿液留取方法。第8 章详尽阐述了生物资源库的标本留取、保存等过程，为开展流行病学调查和大规

5、模临床试验提供研究平台。附录对实验室的常规制度进行了简述。所有的技术都设置了规范化的操作流程、注意事项，并相应地列举了本重点实验室应用这些技术进行的研究示例。对于实验中常见的疑点、难点、热点问题进行了剖析。全书内容丰富、实用性强，适合千肾脏病学及其他医学领域中从事科研的医生、学生或 参阅。 前言 全军肾脏病重点实验室自建立至今已 20 余年。从简单的 PCR 技术到现在的基因芯片、蛋白质组技术；从简单的细胞培养到目前的转基因动物、干细胞技术，全军肾脏病重点实验室跟随着生物学领域的发展， 了生物实验技术的每一次进步。生命科学研究进入分子水平以后，人类对疾病的认识已经较之前有了本质的飞跃，转化医学

6、的发展需要架起基础研究和临床医疗之间的桥梁，本书所涉及的各种规范化实验方法强调基础医学与临床医学之间的联系和互动。 全军肾脏病重点实验室的科研人员和 同志在长期的工作中，本着节约、高效、实用的原则，总结出很多个人独特的实验技巧，摸索出自己 的一套实验流程，这是大部分本专业现有著作上所没有的，具有非常强的实 用性。这些技巧是多年工作经验的结晶，对于提高实验的成功率、决定实验 的成败起着至关重要的作用。本书是一本实用性很强的实验手册，可供分子 生物学、细胞生物学、遗传学、医学基础等领域的研究生、高年级本科生和 其他研究人员阅读参考。尤其是对于实验基础比较薄弱的临床研究生，本书 具有非常强的可操作性

7、，能够让研究生尽快地熟悉实验室的情况， 尽早进入工作状态。 衫爷k医学会肾脏病学分会主任委员中国工程院院士 2011 年 1 月 目录 纶 l 卒 细胞学实验技术 I 匕 比一 第一节细胞培养1一、细胞复苏与冻存1二、原代近曲肾小管上皮细胞的分离培养2三、原代肾小球内皮细胞的分离培养4四、原代肾小球系膜细胞的分离培养8五、原代肾间质成纤维细胞的分离培养10六、足细胞培养12七、细胞共培养15八、成体千细胞培养技术（大鼠骨髓间充质干细胞）16九、细胞脂 转染20十、肾脏细胞电转方法 21十一、细胞原位杂交 23第二节 流式细胞仪技术 26一、普通细胞分选 27二、细胞无菌分选 27三、流式细胞仪

8、检测细胞大小 29四、流式细胞仪检测细胞周期 30五、流式细胞仪检测细胞凋亡 32第三节 共聚焦技术 l 细胞内蛋白质定位、细胞器及自噬体等 亚细胞结构检测36一、共聚焦显微镜常规检测方法36二、细胞免疫荧光染色方法38三、细胞免疫荧光多重染色38四、细胞内脂肪颗粒染色及检测40五、细胞骨架蛋白染色及检测411 -/肾脏病学实验技术操作规程 六、细胞内质网染色及检测43七、细胞内线粒体染色及检测44八、细胞内溶酶体染色及检测45九、细胞内自噬体染色及检测46第四节 共聚焦技术 II 细胞内离子及功能的 实时动态监测47一、 细胞内离子动态检测常规方法48二、细胞胞浆及线粒体Ca2 的染色及检测

9、 49三、细胞内 N旷染色及检测51四、细胞内pH 染色及检测51五、细胞线粒体膜电位的染色及检测53六、细胞内活性氧 (ROS ) 染色及检测54七、细胞内钙离子震荡及钙火花检测56八、荧光光漂白恢复 ( FRAP ) 技术检测细胞间通讯58九、荧光漂白丢失 (F LIP ) 检测细胞膜蛋白的流动性及 蛋白质核转位60十、荧光共振能量转移 ( FRET ) 检测蛋白质相互关系62十一、细胞 x-z纵 切扫描检测极性细胞蛋白定位 64十二、细胞及组织切片三维重建 66第五节 共聚焦技术 Ill- 一荧 光 染 料 探 针标 记样本存 在的 问题及分析对策 70一、荧光标记样品需要注意的问题 7

10、0二、荧光标记实验经常出现的问题及对策 71三、典型举例 71第六节 细胞实验其他技术 73- 、MTT 测定细胞活力 73二、细胞增殖测定( Br dU 技术） 75绾 2 农 分f生物学实验技术 82- 第一节 核酸的提取与纯化82- 、DNA 的提取与纯化822目 录 1二、RNA 的提取与纯化 84第二节 P C R 技术 86一、普通 RT-P CR 技术 87二、实时荧光定量PCR 技术 89第三节 分子杂交 92- 、So uth ern blot92二、Northe rn blot96三、Weste rn blot98第四节 基因克隆 102一、酶切反应与DNA 片段纯化 10

11、2二、连接反应 103三、转化 104四、质粒的提取 105第五节 R NA i 实验原理与方法 108一、R NAi 的分子机制 108二、siR NA 的设计 108三、siR NA 的制备 109四、siR NA 的转染 111第六节 Mic ro R NA 实验技术 112- 、MicroR NA 介绍 112二、用MicroRNA 芯片技术进行MicroR NA 表达谱分析 113三、Micro RNA 表达水平的检测方法 115四、Micro RNA 靶基因的寻找 127五、Mic roRNA 靶基因的鉴定 128第七节 基因芯片 一、实验目的与主要实验原理 129129二、实验材

12、料 129三、实验步骤 129四、结果示例130五、注意事项130第八节 荧光差异显示双向电泳分析技术130一、蛋白质标记与双向电泳131二、差异蛋白质的鉴定132第九节 液相质谱联用技术1353 - -一 肾脏病学实验技术操作规程 一、实验目的与主要实验原理二、实验材料 三、实验步骤四、注意事项五、结果示例 -135135135135136 4 纶：小 的即学技术 138第一节 常规病理技术 138一、组织的取材与固定 138二、石蜡包埋和塑料包埋技术 139三、组织切片技术 140四、常规染色技术 ( HE 染色） 143五、特殊染色技术 144第二节免疫病理技术 149一、免疫组织化学染

13、色 149二、免疫组织化学双重染色 150三免疫荧光染色（直接法） 151四、免疫荧光双歌染色 153五、微波石蜡切片免疫荧光标记 154六、微波石蜡切片免疫荧光双（多重）标记 155七、免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 156第三节 分子病理技术 157一、原位分子杂交的基本原理和过程 157二原位分子杂交的基本操作步骤 158三原位分子杂交与免疫组织化学双重染色 160四、组织细胞凋亡检测 160五组织细胞凋亡与免疫组织化学双重染色 162第四节 电镜技术 163一、透射电镜介绍 163二、透射电镜样品制备 163三、透射电镜的使用 166第五节激光微切割技术 167目录丿 笱

14、 4 卒 转从 技术 169 第一节显微注射 170一、目的DNA 的制备 170二、小鼠的准备和要求 170三、输精管切除术 172四、受精卵的分离 172五、显微注射 174六、受精卵移植 177七、转基因小鼠的鉴定 180八、技术成果 181第二节胚胎干细胞 183第三节逆转录病毒感染 183一、原理 183二、操作步骤 183第四节基因打靶技术 184一、ES 细胞的获得 184二、基因载体的构建 184三、基因打靶载体的导入 185四、用选择性培养基筛选已击中的细胞 185五、观察 185 绾 5 农 肾脏疾病动物校咽 186 第一节 血清病肾炎模型 186一、动物 186二、药品及

15、试剂 186第二节 T hy-1 肾炎模型 188一、实验目的 189二、实验材料 189三、实验步骤 189四、结果示例 1905 - - - l - 肾脏病学实验技术操作规程 五、注意事项 190第三节 Heymann 肾炎 191一、抗体制备 191二、造模 193第四节 阿霉素肾病模型 194一、材料与方法 194二、模型制作方法 194三、检测项目与方法 194四、结果示例 195五、注意事项 195第五节 抗肾小球基底膜肾炎模型 195一、材料与方法 196二、模型制作方法 196五、注意事项 197第六节 庆大霉素所致急性肾小管坏死模型 197一、材料与方法 197二、模型制作方

16、法 198三、检测项目与方法 198四、结果示例 198五、注意事项 198第七节 5 /6 肾切除模型 199一、材料与方法 199二、模型制作方法 199三、检测项目与方法 199四、结果示例 200五、注意事项 200第八节 LPS 肾炎模型 201一、器材及试剂准备 201二、步骤 201三、纤维蛋白免疫荧光染色 202第九节 糖尿病肾病 203一、器材及试剂准备 203 6-I l 一目 录二、步骤203第十节 肾脏缺血再灌注损伤模型205一、实验动物选择及特殊器材205二、实验设计205三、实验步骤205四、病理结果205五、注意事项205第十一节 单侧输尿管梗阻模型206一、实验

17、动物选择206二、实验设计206三、实验步骤207四、病理结果207五、注意事项207第十二节 肾移植208一、实验动物选择及特殊器材208二、实验设计208三、实验步骤209四、注意事项209第十三节 挤压伤肾损伤模型210一、肌内注射甘油溶液诱导横纹肌溶解AKI 大鼠模型制备210二、重物 下肢肌肉诱导横纹肌溶解AKI 大鼠模型211三、静脉注射骨骼肌匀浆（自体）诱 导横纹肌溶解AKI 大鼠模型212第十四节 肾脏发育模型2137 一、肾脏发育基因敲除模式二、肾脏发育模型制备 213214笱 6 农 1-1:!牛埋技术217 一、实验目的 二、主要动物及仪器三、方法及结果 四、注意事项 2

18 勹肾脏病学实验技术操作规程 绾 7 农 留取尿液方法220一、尿液标本的种类220二、尿液标本留取的注意事项220忱 8 米 肾脏病生物样本资源库的建设规范222第一节 肾脏病临床信息数据库的建设 222一、信息采集原则 222二、信息采集流程 223三、信息采集内容 224四、随访信息采集 225五、医学 学要求 225六、人员岗位职责 225第二节 肾脏病样本资源库操作规范 226一、样本库建设原则 226二、样本采集范围和分类 226五、样本处理 228六、样本运输 229七、样本储存 230八、样本出入库管理 230九、质量控制 230十、实验室安全 231十

19、一、人员岗位职责 231附录 A各实验室岗前培训内容234附录 B各实验室工作制度238 8第 1章 细胞学实验技术 第一节 细胞培养 细胞复苏与冻存 （一）实验目的 细胞培养 (cell c ult ure ) 是指在尤菌、适当温度和一定营养条件下 ， 使细胞在体外生存和生长并维持其结构和功能的方法。细胞可以冻存，并且经过复苏后能够恢复其原有 的结构和功能。细胞复苏和冻存技术是细胞培养的基本技术。 （二）实验试剂 细胞冻存液 成分为含 20% DMSO 的胎牛血清 (fet al bovine serum, FBS )、0 .25 胰酶。 （三）实验流程 1. 复苏(1 ) 从液氮中取出冻存

20、细胞 ， 快速解冻。 ( 2) 将冻存细胞液从冻存管中快速移出 ， 加入到 10 ml 的无血清培养液中 （小离心管），轻轻混匀。 ( 3 ) 离心 (1 200 r, 5 min ) 。 (4 ) 弃上清。 (5 ) 加入 10 ml 10% F BS 培养液， 反复吹打混匀。 (6 ) 接种细胞到 25 cm x 25 cm 培养瓶 (5 ml 培养液）， 置于 37C CO2 温箱中培养。 2. . 冻存(1) 0 . 25 胰酶消化培养细胞 (1 ml培养瓶）， 3 7C CO 订盐箱孵育 3 min 后， 加入2 ml 培养液终止消化。 (2) 培养瓶中液体转移至10 ml 离 心管

21、。(3 ) 离 心 (1 200 r, 5 min ) 。 ( 4 ) 弃上清。 (5 ) 加入 0 . 5 ml 10% FBS 培养液， 反复吹打混匀。 l 肾脏病学实验技术操作规程 ( 6 ) 加入 0 . 5 ml 细胞冻存液， 反复吹打混匀。 (7 ) 将混合后的液体移至冻存管 ( 1. 8 ml ) ， 置于20 C 冰箱保存 2 h , 再移到 - 80 C 冰箱， 24 h 后放入液氮中永久保存。 （四）注意事项 1. 遵循慢冻快 复苏原则。冻存细胞要逐渐递减温度， 复苏时操作动作尽量快， 减少冻存液在室温情况下对细胞的损伤。2. 由于冻存管相对较小， 更要注意无菌操作， 防止

22、细胞污染。3. 为了观察细胞冻存后是否存活 ， 需要定期复苏细胞， 观察复苏存活率 ， 保障冻存细胞的活性。（五）常见问题及处理方案 1. 细胞冻存复苏后 ， 大量细胞死亡或者漂浮细胞过多， 怎么办？答： 细胞冻存时状态一定要好 ， 汇合度 70% - 80 为宜， 冻存细胞状态不好，宜接导致细胞复苏后很难成活。 细胞短期可以放置在 80 C 冰箱， 但长期保存必须要放置在液氮中。频繁地开关门将直接导致细胞冻存效果受影响，复苏后可导致大量细胞死亡。 细胞复苏后一定时间内不要移动培养瓶，保证细胞良好的生存状态。贴壁细胞如果不能 及时贴壁附着，很难成活。对千贴壁细胞，在一定时间内需要通过换液来清除

23、漂浮细胞 或死亡细胞，不要让它们影响已经成活细胞的生长。换液时间酌情而定。对于相对不易 千培养的细胞类型，如足细胞，需要酌情在培养瓶中提前铺好胶原等辅助细胞贴壁的试剂， 然后进行复苏。对于悬浮细胞的复苏，要根据细胞显微镜下的细胞生长清况及时收集离 心换液处理。 2. . 细胞反复冻融后 ， 细胞性状是否 发生改变？答：我们一般要从形态学观测，另外要对细胞进行相关生物学检测才能下结论。但首先要先排除培养环境对细胞的干扰， 如： 培养液的pH , 培养液的种类选择等。 二、原代近曲肾小管上皮细胞的分离培养 （一）实验目的 肾小管上皮细胞是肾脏重要的固有细胞，不仅具有重吸收和排泄功能，而且能够分泌

24、众多的细胞因子、生长因子、血管紧张素及炎症介质，参与肾组织纤维化的发生和进展。 肾小管上皮细胞的增殖、凋亡、再生、参与免疫炎症等都与肾组织纤维化进程密切相关。 因此，原代近曲肾小管上皮细胞培养技术是肾脏细胞生物学的重要部分。 （二）实验试剂 1. V 型胶原酶 (13. 6mg/ ml )。2. . 细胞培养用液 10% FBS DMEM 含上皮细胞生长因子 ( Epidermal growth factor, EGF, 10 ng/ ml ) 、 胰 岛 素 (Insu lin , 10 ng / ml ) 、 转 铁 蛋 白 (T ra nsfer rin , 5 g / ml ) 。 2

25、第 1 章 细胞学实验技术 13. KHB 缓冲液（配方见附录）。4. P ER COLL 分离液 广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。（三）仪器灌注泵等。 （四）实验流程 1. 灌注方法 (1) 100 - 150 g SD (Sprague Daw ley ) 大鼠，乙酰麻醉 ，腹主动脉插管，全身肝素化。(2 ) 灌注生理盐水， 清洗肾脏 2 min , 直到肾脏变白为止。利用灌注泵用 V 型胶原酶在 37 C 水浴循环消化15 min 。 (3 ) 观察到双侧肾脏变软后， 用生理盐水冲洗肾脏， 迅速放置冰浴缓冲液中。 (4 ) 用无菌刀片仔

26、细剥离肾皮质， 加入缓冲液， 移到 10 ml 离心管中。 (5 ) 通过 210 m 筛网过滤， 在 80 m 筛网上收集组织 ， 将收集物悬浮于KHB 缓冲 液中。 (6 ) 清洗和离心 3 min, 800 r x 3 次， 利用 PER COLL 分离液进行分 离， 组织经离心后分层。 (7 ) 在显微镜下观察各层组织， 收集近曲小管层， 加入 10% FBS DMEM 中， 放置 于 37C CO2 孵箱中进行培养。 2. 培养 倒置显微镜下观察肾小管纯度达 98% 以上后 ， 置于 37C 5% CO 2 孵箱中， 培养 1 周左右， 即可见原代肾小管上皮细胞生长并融合成片。 （五

27、）注意事项 1. 大鼠动物手术操作相对复杂， 如果不能结扎分支血管，很可能导致灌注消化不充分，造成肾脏组织分离不开。 2. 实验操作过程相对要快些 ， 时间过长容易导致组织细胞活性降低。 3 . 用 PER COLL 分离液进行分离 后， 收集近曲小管层，尽量保证纯度，宁纯勿杂。 （六）细胞鉴定 细胞鉴定采用间接免疫荧光染色法， 即肾小管上皮细胞抗细胞角蛋白及抗角蛋白染色阳性。 （七）培养的近曲肾小管上皮细胞 3 见图 1- 1。 图 1- 1近曲肾小管荧光显微镜下形态 ( x 200 l/归阮病学实验技术操作规程 参考文献 l田 劲，陈香美，黎磊石，等冬虫夏草、大黄及肾大部切除大鼠血清对肾小

28、管上皮细胞生长的影响中西医结 合杂志， 199 I, I l :547-549.2 傅 博，陈香美，李文歌，等用微分离方法培养肾皮质近曲小管和髓质集合上皮细胞及其生物学特征的研究解剖学杂志， 1999,22:63-66.3 李文歌， 陈香美， 程庆砾， 等用共培养体系观察缺氧肾小管上 皮细胞对成纤维细胞的调节作用 内科杂志， 1996,35:810-813.4 Wang J, Ouyang C, Chen X, et al. STAT3 inhibits apoptosis of human renal tubular epithelial cells induced by ATP deple

29、tion/recovery. Nephron Exp Nephrol, 2008, 108: ell-18.附： KHB 缓冲液配方 表 1 - 1表 1- 1KHB缓冲液配方 分子星 终浓度 ( mmol/ L)配制时所加质量 (g / L )NaCl58.440118.006.900KCl74.5604.000.300KH2P04136.0901.000.136NaHC0384.01027.202.258CaCl2110.9901.250.139MgC1295.2301.200.114葡萄糖 (Glucose )180.1605.000.900HEPES238.30010.002.380注

30、： 无菌滤过， 4C 保存 三、原代肾小球内皮细胞的分离培养 （一）实验目的 肾小球内皮细胞是肾组织重要的固有细胞，广泛参与了肾组织的炎症、增殖和硬化 的发生。肾小球内皮细胞的进行性丢失是进展性肾病的特征性变化。掌握原代肾小球内皮细 胞的体外培养技术对于解析肾脏病发生、进展机制具有重要意义。 （二）实验试剂 1. 20% FBS RPMI 1640 培养基。 2. V 型胶原酶 ( 0 . 5 m g / m l )。 3 . 内皮细胞培养液 20% FBS RPMI 1640 中含有： Insuli n (5 g / ml ) ，硒 (Selen ium , 5 ng/ml), Transf

31、errin (3 g/ ml )， 肝素 ( H ep a r in , 5 U / m l ) ， 成纤维细胞生长因子 4 (Fibroblast growth factor, FGF, 2 ng / ml ) 。 （三）实验流程 第 1 章 细胞学实验技禾/ 5 1. 脏组织， 4c 生理盐水冲洗 ， 剥离肾包膜， 用剪刀把肾皮质剪成碎块。2. . 将研磨组织放入重叠不锈钢筛网（孔径 为 250 m , 106 m , 75 m ) 。3. 在最上层 (250 m ) 筛网上用消毒针筒内蕊轻压肾皮质，同 时 用 4 C 生理盐水轻轻冲洗， 滤入第二层筛网中 ( 106 m ) 。4. .

32、继续用生理盐水冲洗 第二层筛网， 同时轻研组织，滤 过第三层筛网中 (7 5 m ) 。5 . 在第三层滤器上吸出少许组织， 镜下观察，若只 有纯净小球而几乎不含小管即可停止冲洗，（肾小 球纯度 95%) , 收栠此层组织移入离心管。 6 . 离心弃上清，酌 情加入 2 - 3 ml V 型胶原酶充分混匀 37C 孵箱 15 min , 边消化边观察， 首先使肾小球从包曼氏褒中剥离， 终止消化，离心分 离肾小 球，继 续置V 型胶原酶中消化，细胞散出但又不破碎为适度。 7 . 用 10% FBS RPMI 1640 终止消化，800 r 离 心 2 - 5 min , 上清移至其他离心 管，

33、1 500 r 离心 10 min , 取沉淀混匀分散后加入内皮细胞培养液， 计数后分瓶入 3TC CO2孵箱内培养。 （四）肾小球内皮细胞鉴定 1. 由于目前的细胞鉴定方法 单一， 选择不尽全面，宜 用多种方法检测然后综合分析， 表 1-2 从不同方面列举了肾小球内皮细胞的 特性。表 1- 2 肾小球内皮细胞的特性 检查方法 相差显微镜检查电镜检查 铺被基质胶细胞 ELISA免疫组化检查 其他检查 内皮细胞特点 与肾小球上皮细胞形态相似，可呈环状排列 细胞表面有少量微绒毛，胞体布满窗孔，有紧密连接可有管型形成 表达黏附分子： 细胞周黏附分子 l (Intercellular adhesion

34、 molecule-1, ICAM-1) 、血 小板内皮细胞黏附分子(pl atelet/ endothe lial cell adhesion molecule-1, PECAM-1 ) 、E选 择素 (E-s electin )抗VIII因子、抗血管内皮钙粘素等抗体染色阳性 能合成及分泌血管紧张素转化酶 国外研究显示，利用相差显微镜能够观察到肾小球内皮细胞由多个多边形细胞组成 了一个单细胞层。形态学上与上 似，但是明显不同于肾小球系膜细胞。如果把血清降 至 2%，它 们将处于静止状 态。72 96 h 后， 大部分细胞从壁上脱落， 剩余的细胞延伸出毛细血管样的结构。目前在类似毛细血管结构中

35、出现的开窗式结构还没有报道。内皮细胞 开窗式结构形成需要特定的条件，开窗结构的出现伴随着细胞融合数量的增加。 利用电子显微镜发现，单层内皮细胞之间有紧密连接、细胞内有丰富的细胞骨架和 丿脏病学实验技术操作规程 微管及微细纤维、大量的线粒体和发育良好的高尔 基体以及怀布尔 帕拉德体 (Wei bel Palade body, 内皮细胞特征小体 ）。细胞表面可以观察到稀少的 微绒毛。培养的肾小球内皮细胞VIII因子相关抗原染色阳 性。 2. 鉴定肾小球内皮细胞的方法(1 ) 形态学鉴定： 光镜观察 ， 生长活跃的内皮细胞体积中等 ， 为扁平的多边形、卵圆形或纺锤形，大小均匀。胞核清晰，多居中央，呈

36、圆形和椭圆形。少部分细胞胞质形成 细长突起，似毛细血管样。生长成片后的内皮细胞成单层铺路石样镶嵌排列生长，并 有接触抑制现象， 见图 1- 2。 (2) ) 间接免疫荧光鉴定： 选择生长最佳时期的肾小球内皮细胞 ， 然后分别加入抗VIII因子、相关抗原、结蛋白、细胞角蛋白、 IV 型胶原、纤维连结蛋白、层黏连蛋白抗体， 免疫荧光染色后观察。肾小球内皮细胞VIII因子免疫荧光染色阳性， 结果见图1-3。图 1- 2 原代培养的肾小球内皮细胞( x 200 )图 1- 3 肾小球内皮细胞VI因子染色阳性 ( X 400) 6 第 1 章 细胞学实验技术/ / - (3) 肾小球 内皮细胞与其他细胞

37、的鉴别： 利用间 接免疫荧光进行鉴定，以 同 期培养的来自同一肾脏的系膜细胞作对照，鉴 定结果见表 1-3。内 皮细胞的第VIII因子相关抗原染色为阳性， 而结蛋白、角蛋白 、细胞角蛋白均为 。 系膜细胞VIII因子相关抗原为 ， 结蛋白为阳性。 组分 表1 - 3肾小球内皮细胞和系膜细胞的鉴别 内皮细胞 系膜细胞 VI11因子相关抗原 结蛋白 角蛋白 细胞角蛋白 IV型胶原 + + 纤维连结蛋白 层粘连蛋白 + + （四）注意事项 1. 人、大 鼠、小鼠肾脏取材一定保证是新鲜组织。2. 要严格无菌操作。3. 根据组织的不同来源进行筛网的选择，成 人 、大鼠、小鼠各不相同 ，酌情 而定。4.

38、. 在实验过程中，研磨的 力 度不 能太重， 太重会把肾小球磨碎， 又不能太轻， 过轻将导致块状组织太多。5. 消化时 间要掌握好，一 般 V 型胶原酶取 0 . 5 mg/ml, 37C 15 min , 一定要镜下不断观察。 6. 离心转速要掌握好条件， 每次实验要严格操作， 如果离心转速太低， 会导致内皮细胞收集不纯；转速太大，会丢失一部分内皮细胞。7. . 由于内 皮细胞比较娇嫩， 在选择 瓶皿时最好选用塑料培养瓶， 同时明胶包被。8. 定期观察细胞，但切记 太 过频繁，以免 影响细胞正常生长状态。相对于成人肾小球内皮细胞培养来说，大鼠肾小球内皮细胞的分离培养取材更方便、快捷，实验中如

39、有条件最好通过灌注泵进行原位灌洗。不经灌洗的肾小球因其中含有大量 的血细胞，致使肾小球贴壁慢，甚至不贴壁。而经灌洗后培养的细胞生长状态较好。 参考文献 l 陈香美， 傅 博肾小球内皮细胞王海燕主编肾脏病学第3 版， 北京： 人民卫生， 2008;653-657.2 Kang D-H, Kanellis J, Hugo C, et al. Role of the Microvascular Endothelium in Progressive Renal Disease. J Am Soc Nephrol, 2002,13:806-816.7 肾脏病学实验技术操作规程 34 陈香美， 于力方，

40、陈， 等肾小球内皮细胞培养及产生细胞外基质的实验研究 医学杂志， 1995, 75:25-28.5 陈香美， 徐启河， 段永刚， 等狼疮性肾炎患者血清抗肾小球内皮细胞抗体变化及其临床意义 内科杂志， 19 95,34:411-412.6 徐启河， 陈香美， 傅 博，等凝血酶对肾小球内皮细胞和系膜细胞增殖的影响医学杂志， 1 997,22:440-441.7 Xu Q, Chen X, Fu B, et al. Integrin alphavbeta3-RGDS interaction mediates fibrin-induced morphological changes of glomer

41、ular endothelial cells. Kidney Int, 1999,56:1413-1422.四、原代肾小球系膜细胞的分离培养 （一）实验目的 肾小球系膜细胞及系膜基质定位于肾小球毛细血管撑间，它们除能支撑毛细血管外， 还能发挥其他重要生理作用。例如，通过系膜细胞自身收缩及产生的血管活性物质调控肾 小球血流；通过吞噬及降解作用清除从血浆沉积至系膜区的大分子物质；通过分泌生长因 子调节细胞外基质合成、降解，参与系膜基质更新。在病理条件下，系膜细胞与其他肾组 织细胞一样，不但是疾病的受害者，而且也是直接参与者，它能通过自身细胞增殖及转分 化，产生各种炎症介质、致纤维化物质及其抑制物而

42、影响疾病过程。掌握体外培养原代系 膜细胞技术，对研究肾脏疾病发病机制具有十分重要作用。 （二）实验试剂 1. 15% FBS RPMI 1640 。2. V 型胶原酶 ( 0 . 5 mg / ml )。3 . 系膜细胞培养液 15% FBS RPMI 1640 培养液 100 ml 中加上 325 l 胰岛素（终浓度为 5 g / ml )。 （三）实验流程 1. 取新鲜肾组织，用无菌 4 C 生理盐水冲洗，剥离肾包膜， 用剪刀把肾皮质剪成碎块。 2 . 放入重叠的三层不锈钢筛网（ 孔径为 250 m,106 m,75 m ) 。 3. 在最上层筛网上用消毒针筒轻研肾皮质， 同时用 4 C

43、生理盐水冲洗 ， 使其滤入下层筛网 (1 06 m ) ， 用生理盐水冲洗这一道筛网 （同时轻研组织）。4. 组织漏入 75 m 这层筛网时， 尽量只冲不研磨， 吸出少许组织， 镜下观察， 若见纯净小球 ( 98 纯度）即可停止冲洗， 收集此层组织移入离心管 ， 见图 1-4 。 5. 800 r, 3 m i n , 弃上清， 离心管中酌情加入 2 - 3mlV 型胶原酶， 在 3 T C 孵箱充分消化 15 m in 。 81第 旧胞学实验聂朵 一- - - 血. - 6. . 边消化边观察 ，以 肾小球中有细胞散出但又不破碎为适度， 用 10% FBS RPMI 1640 培养液终止消化

44、。 7. 800 r, 2 - 5 min , 收集肾小球置培养瓶中孵育。培养的系膜细胞， 见图 1-5 。（四）细胞鉴定 细胞鉴定采用间接免疫荧光方法鉴定培养细胞 ， 抗结蛋白抗体为阳性。见图 1- 6。 图 1- 4 光镜下纯净肾小球 ( X 100)图 1- 5光镜下培养的肾小球系膜细胞 (X 100)图1- 6 荧光显微镜下肾小球系膜细胞抗结蛋白抗体阳性 ( x 400 )9 肾脏病学实验技术操作规程 （五）注意事项 1. 选择新鲜、青年肾组织 ， 分离提取的原代系膜细胞生长效果比较好。一般取 6 8 周大鼠肾组织。 2. 镜下观察组织十分重要 ， 要保证收集肾小球的纯度。3 . 分离

45、好的肾小球放置培养瓶中3 d 内不要移动， 利于肾小球贴壁生长。 参考文献 1 Ronco P, Ardaillou R, Baud L, et al. Biology of renal cells in culture. In: Grenner BM, ed. The Kidney, 7th ed, Vol I. Philadelphia: Saunders. 2004;105-198.2 Rodriguez-Barbero A, LAzou B,Cambar J, et al. Potential use of isolated glomeruli and culture mesangia

46、l cell as a in vitro models to assess nephrotoxicity. Cell Biol Toxicol, 2000,16:145-153.3 Lee GS. Mesangial cell culture: its role in the understanding of the pathogenesis of glomerular disease. Ann Acad Med Singapore, 1995,24:851-855.4 于力方， 陈香美， 黎磊石， 等正常人肾小球系膜细胞培养的研究 肾脏病杂志 ， 19 90,6: 70-74.5 段永刚，

47、陈香美， 等 I 型胶原、内皮素对肾小球内皮细胞及系膜细胞产生细胞外基质的影响 细胞生物学杂志 ， 1 995,17:48.6 蒋工伟， 陈香美， 黎磊石， 等血清促肾因子对肾小球系膜细胞生长的影响 肾脏病杂志 ，1990,6:367-368.7 陈香美， 田 劲， 黎磊石， 等小鼠肾小球系膜细胞白介素 1 基因表达的研究 医学杂志， 1 991,71:11-13.8 林洪丽， 陈香美， 傅 博， 等正、反义组织金属蛋白酶抑制剂 1 基因转染对肾小球系膜细胞凋亡及相关基因表达的影响 医学杂志 ， 2001,81:411-414.9 Chen XM, Wang JZ, Fu B, et al.

48、RGD-Containing Peptides Trigger Apoptosis in Glomerular Mesangial Cells of Adult Human Kidneys. Biochemical and Biophysical Research Communicatoins, 1997,234:594-599.五原代肾间质成纤维细胞的分离培养 （一）实验目的 成纤维细胞作为肾间质中的固有细胞，在肾间质纤维化发生、进展上具有重要调控作 用。掌握原代肾间质成纤维细胞的分离和培养技术，对于阐明肾间质纤维化过程中成纤 维细胞的分化、成熟和增殖规律，研究肾间质纤维化发生和进展机制非常

49、重要。 （二）实验试剂 1. V 型胶原酶 ( 0 . 5 mg/ ml ) 。 10 第 1 章 细胞学实验技术厂 2. . 细胞培养用液 10% FBS DMEM 。 （三）实验流程 1. 100 - 150 g SD 大鼠， 乙酰麻醉， 腹主动脉插管， 全身肝素化。2. 灌注生理盐水， 清洗肾脏 2 min , 直到肾脏变白为止。3. . 将肾皮质部分剪成细条置于100 目钢筛上研磨。4. . 生理盐水冲洗后于 150 目网筛上收集肾小管节段。5 . 肾小管节段悬浮于10% FBS DMEM 培养液， 在冰上静置15 - 20 min , 弃上清。 6 . 重新悬浮于 10% FBS DMEM , 放入孵箱培养。 （四）注意事项 1. 灌注要彻底， 血液细胞对肾脏细胞生长有影响， 尽量去除。2. . 培养 2 4 d 即可见细胞生长， 每 4 5 d 传代一次， 连续传 3 代后肾小管上皮细胞逐渐死亡才可获较纯净的