南师大细胞生物学-考研课件-第3章+细胞生物学研究方法

1、第三章 细胞生物学研究方法,1细胞形态的结构结构的观察方法 2细胞及其组分的分离、显示鉴定及定量技术 3细胞体外操纵技术,知识点：,第一节 细胞形态结构和观察方法,细胞的形态观察 细胞的大小和计量单位 鸵鸟卵 =12-15cm 人卵细胞 =0.1mm 多数细胞 =10-30m 血细胞 =7m,显微镜观察范围 肉眼观察范围,显微镜观察范围 (C) DIC microscopy; and (D) dark-field microscopy.,四种观察方式比较,（七）录像增加反差显微技术,录像机+图象处理技术 高度光敏感摄像机 获取信号可以数字化后输入计算机 计算机 弥补光学系统的缺点而达到理论上的

2、分辨率,0.61分辨率 D = N=1, Sin180/2=1 N.Sin(/2) 越小分辨率越高 人们寻找更短波长的照明物质以提高分辨率光学显微镜的分辨率在理论上不能小于0.2nm,这是因为受光波波长的局限, 即可见光的波长不能小400nm。电镜是利用电子束对样品放大成像的显微镜， 电子束波长为0.01-0.9nm，因而分辨率大大提高。,二、电子显微镜技术,（一）电子显微镜的基本知识 1. 电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数 分辨本领：电镜在最佳状态下的分辨率可达0.2nm 放大倍数：电镜比光镜观察到更加细微的结构，主要是因为电镜具有更高的分辨率而不是通常所说的放大倍数高。,2.电镜与光镜的

3、基本区别 光镜 电镜 光源 可见光（300-700nm） 电子束 紫外光（200nm） 分辨率 100-200nm 0.1nm 透镜 玻璃透镜 磁透镜 真空 无要求 1.3310-310-5 Pa,TEM,3.电镜的基本构造,电子照明系统 电子枪 （高频电流加热钨丝发出电子） 聚光镜（静电透镜）汇聚电子束 电磁透镜成像系统 物镜、中间镜、放大镜 真空系统 保持电子枪、镜筒和记录系统的高真空 记录系统 荧光屏和 感光胶片 电源系统 供给高压、恒电电压和电流,电镜的类型,透射电镜 TEM（Transmission ElectronMicroscope） 内部结构观察 扫描电镜 SEM （Scann

4、ing Electron Microscope） 外部形态观察 扫描透射电镜 STEM（Scanning Transmission Electron Microscope） 外部形态及内部结构观察 超高压透射电镜 （Ultra-voltage Transmission Electron Microscope）活体观察,扫描电镜,结构和原理扫描电镜利用从块状样品表面收集到的信号电子成像,因此相当于一种“反射式”显微镜(个别情况下也可采用透射模式)。,This mold was growing on a block of Romano cheese in my refrigerator. It w

5、as bluish green, and is probably a Penicillum. The parts of mold you usually see are the reproductive structures; the hyphae underneath them are the parts that feed on whatever its growing on. In this picture the yellow parts are called conidiophores, and the green spores are called conidia,Unstaine

6、d bacteriophage T4.,A freeze-dried preparation of bacteriophage T4 and TMV. The virus consists of a head (normally full of double-stranded DNA), a tail tube, a baseplate at the end of the tail tube and thin tail fibers attached to the base plate. The particle at the lower right has lost its DNA. The

7、 mass per unit length of a tail fiber is 866 +/- 76 kDa, indicating it is a trimer. The full-scale of the dark-field micrograph is 0.512 microns.,（二）主要电镜技术介绍,生物样品电镜技术的特殊要求 样品薄 ultrathin section 精细结构好 fixation 具反差 staining,主要电镜技术 1. 超薄切片技术 2. 负染技术 3. 冰冻电镜技术 4. 金属投影技术 5. 冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术 6. 暗场电镜技术 7. 整装细

8、胞电镜技术 8. 包埋去包埋剂超薄切片电镜技术 9. 高分辨率电镜技术 10. 扫描电镜技术,1. 超薄切片技术 固定 包埋 切片 染色 观察,2.负染技术,重金属盐包埋 Electron micrograph of negatively stained synthetic actin filaments. Actin filaments are double-helical polymers consisting of two linear strands of 42-kD actin subunits that are helically twisted around each other

9、. The inset reveals a 3-D volume-rendered representation of a filament 3-D reconstruction.,负染就是用重金属盐如磷钨酸或醋酸双氧铀对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右,Several of the T bacteriophage viruses,3. 冰冻电镜技术避免化学固定剂、包埋剂等有机溶剂的影响，最大限度地保持样品真实性,Fig. 1-7: Traditional thin secti

10、on of a cultured fibroblast that was quick-frozen by slamming it onto a liquid helium -cooled copper block, and then freeze-substituted. Within the stress fibers (SF; see also Fig. 1-3), individual actin filaments (see also Fig. 8) are clearly resolved. The unaggregated, wider filaments (MT) are mic

11、rotubules, and the small dark particles (R) represent ribosomes,4. 金属投影技术,铂、钯、铬等在真空中加热蒸发,Fig. 1-9: Electron micrograph of a mixture of myosin and nuclear lamin (L) dimers after glycerol spraying/rotary metal shadowing with platinum. Both molecules are composed of two globular heads linked to a commo

12、n rod-like tail, approximately 100 nm long in the case of myosin and 52 nm in the case of nuclear lamin.,Fig. 1-12: Surface topography of metal-coated bacteriophage T4 polyheads recorded by STM (a, c) and by TEM (b, d). Raw data, topograph recorded in the STM (a), and shadowgraph in the TEM (b). Sur

13、face reliefs (c, d) computed (c) from STM topograph in (a), and (d) from TEM shadowgraph in (b).,5. 冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术,冰冻蚀刻 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100度的干冰或-196 度的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面 的结构。冰升华暴露出标本内部结构的步骤称为蚀刻（etching）。蚀刻后，再向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，

14、此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,A,B,C,透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较,三、扫描隧道显微镜,利用量子力学中的隧道效应，当原子尺度的针尖在不到1纳米的高度上扫描样品表面时，针尖与样品之间产生隧道效应，并且隧道电流(I)与针尖、样品间距(d)有一指数关系，这样d转化为I的函数可以测定，针尖的位置就可以测定，由此样品的表面形貌可以测定。,Figure 1-3. Comparison of constant-heightand constant-current mode for STM,Fi

15、gure 1-2. Schematic of tip and sample interaction,Here is a STM image showing iron atoms (Fe) adsorb on a copper (111) surface forming a “quantum corral” in a very low temperature (4K). Actually, the image shows the contour of the local density of electron states. The corral is about 14.3 nm in diam

16、eter.,原子力显微镜ATOMIC FORCE MICROSCOPY,一种利用原子与分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术。它有一根纳米级的探针，被固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上。当探针很靠近样品时，其顶端的原子与样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲，偏离原来的位置。根据扫描样品时探针的偏离量或振动频率重建三维图像，就能间接获得样品表面的形貌或原子成分。,基本原理,提供真正的三维表面图 不需要对样品的任何特殊处理 在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作,One of the advantages of AFM is that it can image the non-con

17、ducting surfaces. So it was immediately extended to the biological systems, such as analyzing the crystals of amino acids and organic monolayers.,第二节 细胞组分的分析方法,一. 细胞及细胞组分的分离与纯化 （一）细胞的分离技术 1. 破坏细胞外基质及细胞连接 （蛋白水解酶和EDTA） 2. 从混合细胞群体中分离出不同类型细胞 物理（沉降、离心 / 粘附能力） 免疫（耦联材料：胶原、多糖小珠或塑料） 荧光染料耦联抗体标记，流式分选,（二）超离心技术,

18、细胞群体 细胞崩解（低渗、超声粉碎、强制过滤或研磨） 差速离心 亚细胞组分和各种颗粒,细胞内组分分离,（三）细胞的选择性抽提,化学抽提法选择性地抽提细胞的某些成分 如：研究细胞骨架 Cell Triton等非离子去垢剂抽掉CM+可溶性成分 骨架蛋白质体系 进一步抽提 核骨架-核纤层-中间纤维体系 蛋白酶消化蛋白质 核骨架+DNA,（四）柱层析技术和电泳技术分析蛋白质与核酸分子,可溶性细胞提取液中的蛋白质可用柱层析方法纯化 蛋白质 分子量 带电性 分子亲和性 蛋白分子量和亚基组成可用SDS(十二烷基磺酸钠）-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定 分子量较大的不同核酸序列用琼脂糖凝胶电泳分析分离,二

19、. 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖、脂等的显示方法,DNA Feulgen反应 Shiffs试剂 紫红色 多糖 PAS反应 Shiffs试剂 脂肪 四氧化锇+不饱和脂肪酸=黑色 苏丹（深红色） 蛋白质 Millon反应 红色 酶 如碱性磷酸酶的格莫瑞(Gomori)方法,三、特异性蛋白抗原的定位和定性,（一）免疫荧光技术 免疫学方法+荧光标记技术 主要程序 荧光抗体制备、标本处理、免疫染色、观察记录 （二）免疫电镜技术 免疫学方法+电镜标记技术 主要程序 同上,（三）免疫印迹技术（Western Blotting),聚丙烯酰胺凝胶电泳过的蛋白质 转移到硝酸纤维素滤膜上 1. 与某蛋白抗原的第一抗体

20、反应； 2. 与酶相连的抗第一抗体的第二抗体反应； 3. 酶与对应底物反应，显色。,(四）放射免疫沉淀分析(RIPA)技术,可以对目的抗原（蛋白质）进行定性定量分析 1. 靶蛋白的同位素标记 2. 裂解细胞 3. 抗原抗体反应形成免疫复合物 4. 收集与分离免疫复合物（通常用固化的protein A) 5. 对分离的免疫沉淀物中的标记化合物进行分析，用聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS或发射自显影技术 优点：1.特异性高；2.灵敏度高； 3.运用脉冲标记追踪可进行目的蛋白的动态分析。,四、细胞内特异核酸的定位与定性,（一）原位杂交技术 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸顺序 光镜 电镜,(二）S

21、outhern印迹技术,Southern印迹技术：把凝胶电泳上分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维膜上，做成一个凝胶复制品。使该膜与放射性DNA探针杂交，通过放射自显影可辨认出与DNA探针互补的特殊核苷酸顺序。 Northern印迹技术：放射性探针与RNA杂交过程。,六、利用同位素技术研究生物大分子在细胞内的合成动态,放射自显影：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶(含AgBr或AgCl)的感光作用，显示样品中同位素的研究方法。灵敏度高 如：1. 首次证明核仁是合成RNA的场所（尿嘧啶核苷首先掺入到核仁）；2. 染色体的半保留复制。 主要步骤： 同位素标记的大分子前体的掺入 细胞内同位

22、素所在位置的显示,（一）显微放射自显影 仓鼠细胞核的3H-TdR,（二）电镜放射自显影,七、定量细胞化学分析技术,（一）显微分光光度测定技术 Figure G.2. Schematic light transmission,显微分光光度测定Spectrophotometry Use of the Spec 20,（二）元素分析电镜技术,电子束 非弹性散射 样品 X射线 非弹性散射电子失去的能量是一个特征值，用它成像便能反映出元素的性质. 能量损失谱成像技术(ESI)直观显示样品中某元素的分布 X射线也是一个特征值 X射线微区分析不直观显示元素分布,（三）流式细胞术与流式分选,流式细胞术 在流动

23、的状态中检测细胞或颗粒的各项特性 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，培养细胞 流式分选 以流动状态的单个细胞的各项特性进行细胞分离 也叫作 Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS),1、概念,2、流式工作原理,通过激光激发高速流动的单个细胞所携带的各种荧光素和荧光染料，并检测由此产生的散射光和荧光的发射光，通过各种光信号的强弱来反应细胞的各种特征。,Flow Cell,Injector Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam

24、,Sheath fluid,Purdue University Cytometry Laboratories,3、流式分析的类型,荧光标识 Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) 机械力分选 Mechanical Sorting 电荷分选 Electrostatic Sorting,488 nm laser,-,Fluorescence Activated Cell Sorting,Charged Plates,Single cells sorted into test tubes,FSC Sensor,Fluorescence detector,

25、Mechanical Sorting: Takes place within a Flow cell,When a sort decision “Green cell” has been made it is diverted into a catcher tube either by moving the tube into the stream:,Laser beam interrogates cells,o,o o,o o o,o o o o,o o o o o,or by applying an acoustic pulse to the stream to divert the ce

26、ll into the tube.,o o o o o o,o o o o o o,o o o o o o o,o o o o o o o o,o o o o o o o o o o,o o o o o o o o o o o o,Electrostatic Sorting : Stream-in-air,Laser interrogation and signal processing followed by sort decision : white sort right, blue sort left, green or black no sort.,Electronic delay u

27、ntil cell reaches break off point. Then the stream is charged : + if white - if blue.,第三节 细胞培养、细胞工程与显微技术,一、细胞培养 （一）原核生物培养 细菌培养 （二）真核单细胞生物培养 酵母、四膜虫 （三）动物细胞培养,（三）动物细胞培养,原代细胞 110代以内的细胞 传代细胞 在体外培养条件下持续传代培养的细胞 接触抑制 贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停止分裂生长的现象 细胞株 (Cell strain) 极少数细胞可以在传10代后可渡过危机而传下去40-50代次并仍保持原来的染色体的二倍体数量及接触抑制行为 细胞系 (Cell line) 细胞发生了遗传突变，并带有癌变特点，能在培养条件下无限制地传下去 如Hela细胞系,体外培养细胞两种基本形态： 1. 成纤维样细胞 2. 上皮样细胞 培养方式和注意点： 贴壁培养 悬浮培养 条件复