生物选矿技术第三章

1、第一节选矿用微生物,1、选矿微生物种类及生理生态特性 生物选矿工业用的微生物绝大多数为细菌，迄今已报道的浸矿细菌至少遍布13个属，营养类型从专性自养型到兼性自养型和异养型。 其中大部分属于自养菌，某些异养菌也可以溶浸金属矿物，在生产中得到实际应用的主要是自养类微生物。,第三章 选矿用微生物与浸矿工艺,自养化能菌的特征 靠氧化培养基中的亚铁离子或硫化合物取得能量，以空气中的CO2作为碳源，并吸收培养基中的氮、磷等无机盐营养，合成菌体细胞物质。 化能自养型细菌为还原CO2而需要的ATP和还原力H是通过氧化无机底物(H2S、S、H2和Fe2+等)来实现的。 菌的生活需要氧气，属于好氧菌，它们广泛生活

2、于金属硫化矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水中。 除利用的能源有差异外，其他性质都十分相近。,如氧化亚铁硫杆菌可将S或硫代硫酸盐氧化成硫酸和将氧化亚铁氧化成高铁，氧化率达95100并放出能量。 2FeS2+7O2 +2H2 O 2FeSO4 + 2H2SO4 2FeSO4 + 2H2SO4 + 1/2O2 Fe2（SO4 )3 +HO2,生成的Fe2（SO4 ）3是强氧化剂和溶剂，可溶解矿石。如溶解铜矿（CuS），从中浸出铜元素。 CuS+ Fe2（SO4 ）3 Cu SO4 + 2FeSO4 + S,溶出的CuSO4 液再加入铁屑、废铁等便可将铜置换出来。生成的FeSO4和S还可在这类细菌作用下再次

3、氧化成H2SO4和Fe2SO4，而循环使用。,浸矿细菌按其适宜的生长温度范围分为三个类型:嗜中温细菌、中等嗜热细菌和极端嗜热细菌。 (1)嗜中温细菌(Mesophile)： 最佳生长温度28一45，主要包括氧化硫硫杆菌、氧化亚铁硫杆菌和氧化亚铁钩端螺菌。它们嗜酸、严格好氧、无机化能自养，广泛存在于金属硫化矿和煤矿等矿山的酸性矿坑水中。,(2)中等嗜热细菌(Moderate thermophile)： 最佳生长温度45-55 ，主要有硫化芽孢杆菌属,已鉴定的有Sulfobacillus thermosulfidooxidans， Sulfobacillus acidophilus，为无机化能兼性

4、自养菌, 绝大多数需要酵母提取液或某种有机物为营养物.有坚固的细胞壁, 能耐受较高的矿浆浓度和较高浓度的金属离子, 因此该菌属在从硫化矿提取金属特别是从难选冶金矿回收金属方面展现了潜在的应用前景.,(3)极端嗜热细菌 (Extreme thermophile)： 最佳生长温度60-85，多为古细菌，主要包括硫化叶菌属。为兼性化能自养菌、嗜酸、极端嗜热, 可氧化亚铁和元素硫。 其中，嗜中温菌和中等嗜热菌已成功应用于硫化矿的生物氧化中，在低于45时以嗜中温菌为主;在45一60范围内，以中等嗜热细菌为主;在40一45的范围内可能有些重叠。 高温嗜热细菌在实验室已进行了扩大试验，但还未进行大规模的工业

5、应用。,浸矿细菌种类及其主要生理特征,阳性,1.5-2.5,1.0-3.0,1.5-1.8,2.0-3.0,一、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans） 特征： 属原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。 是专性化能自养菌，主要利用CO2为碳源，氮源为NH4+,并吸收磷等无机营养来合成自身细胞。营好氧呼吸，属革兰氏阴性菌。 广泛存在于土壤、海水、淡水、垃圾、硫磺温泉和沉积硫内，尤以金属硫化矿和煤矿等酸性矿坑水(PH4)中最为常见。 菌体呈杆状，它可以氧化亚铁为高价铁，也可将硫代硫酸盐氧化为硫酸。,常见的浸矿自养菌, 含亚铁的液体培

6、养基中，亚铁被氧化使培养基由浅绿色变成红棕色，Fe3+水解成氢氧化物或铁矾沉淀。在固体培养基上长成红棕色菌落。 用不含铁的液体培养基，则由于硫代硫酸盐氧化生成硫酸，使培养基酸度提高。 可以氧化Fe2+、元素硫(So)和还原态硫化物。 生长温度：5-40；最适pH值：1.2-6.0,二、氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) 特征： 为圆头短杆状，通常以单个或成双、成短链状存在，在菌体两端各有一油滴，可将培养基中的硫溶入油滴之中再吸入体内进行氧化 其氧化元素硫的能力比氧化硫化合物的能力强，可以产生较多的酸，并有较强的耐酸性能，可耐5%的硫酸。生长温度：5-40

7、；最适pH值：0.5-6.0. 能氧化元素硫，不能氧化Fe2+；,三、喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus，简称A.caldus) 1994年首次报导,属微生物中原核生物界、化能营养原核生物门、细菌纲、硫化细菌科、硫杆菌属。 主要以S为能源物质，也可以利用硫代硫酸钠以及连四硫酸盐为能源，以空气中的CO2为碳源自养生长;不能利用有机物为唯一营养物质异养生长;酵母膏，蛋白膝等有机物对它的生长有一定的抑制作用;少量的葡萄糖可以刺激它的生长. 中度嗜酸嗜热,革兰氏阴性菌，最适生长温度为40一50。最适生长pH为2.在pH为1.5的时候仍能很好的生长.,四、钩端螺旋菌（Lepto

8、spirillum） 细菌形状为弧状或螺旋状，细菌长为0.9一3.5um，宽为0.2一0.6um，革兰氏阴性。借助于单极鞭毛运动。 好氧;专性化能无机自养;通过将二价铁氧化成三价铁获得能量,有机质的存在对其生长有抑制作用。不能氧化硫和硫的其它还原性化合物。生长在极端酸性(pHI.5一1.8)的环境中。嗜铁钩端螺旋菌（L. ferriphilum）能够生长在45，而氧化亚铁钩端螺旋菌（L. ferrooxidans）生长在40以下。 在三价铁离子浓度高的条件下, Leptospirillum 属菌株占浸矿微生物种群的优势, 是主要的铁元素氧化者。,2、冶金微生物的一般性特征 目前所研究的与采矿有

9、关的微生物都具有几个共同的生理特征: 营养类型一般属于化能无机自养型，以CO2为碳源。尽管主要的采矿微生物之间对二氧化碳的固定效率存在着差异，但它们都能固定二氧化碳。只不过固定效率较低的种类往往需要较高浓度的二氧化碳或少量的酵母提取物才能迅速地生长. 能够利用亚铁离子或还原性无机硫(或二者都能利用)作为电子供体，一般以O2为电子受体;尽管某些采矿微生物能够使用Fe3+（并不是氧气)作为电子受体，但它们通常在氧气充足的条件下生长得更好。 大多数种能够生长在极端酸性的环境中(pHI.4一2.0)，由于对硫的氧化所形成的副产物为硫酸，因而如此，甚至对于那些仅仅能够使用亚铁作为能源的采矿微生物来说，也

10、能够生长在这种极端酸性环境中。 尽管不同种或同种内不同株系之间对金属的抗性存在着某些差异，但它们通常都能耐受一定范围浓度的金属离子。At. ferrooxidans appears to be particularly resistant to metals and the bacterium has been reported to grow in medium containing Co2+ (30 g/l), Cu2+ (55 g/l), Ni2+ (72g/l), Zn2+ (120 g/l), U3O8 (12 g/l) and Fe2+ (160 g/l).,第二节 选矿细菌的采集

11、、分离与培养 1) 采集 地点 浸矿细菌可分布于土壤、水体及空气中，但较为集中的地方是金属硫化矿及煤矿的酸性矿坑水。所以采集这类菌的最佳取样点是煤矿、铜矿、铀矿等有酸性矿坑水的地方。如，矿坑水的pH值为1.53.5并呈棕色（说明有Fe3+存在），则很可能存在氧化铁硫杆菌。,采集方法 取50-250mL细口瓶、洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于120烘箱灭菌20min，冷却后可作为细菌取样瓶，带取样瓶到上述矿山取酸性坑水。,2）培养分离 步骤 1、配置培养基 液体培养基 由水和溶在水中的各种无机盐组成的，液体培养基用于粗略地分离培养某种微生物。,浸矿自养菌的液体培养基是由水和溶在水中的各种

12、无机盐组成的，不能存在有机物。每种细菌都有自己特有的培养基配方，这些配方是经过研究者的试验研究之后得出的。例如氧化铁硫杆菌培养基配方为 硫粉 10克 MgSO4.7H2O 0.5克 (NH4)2SO4 0.4克 FeSO4 0.01克 KH2PO4 4克 CuCl2 0.25克 水 1000ml,固体培养基 平板分离用的固体培养基，是在液体培养基中加入1.5%琼脂（洋菜）或一定量硅胶制成的。 方法：在加热条件下配成一定浓度的消毒琼脂溶液后，再加入无菌过滤的FeSO4等无机盐母液，冷却至常温即制成固体培养基。 进行微生物的纯种分离则要用固体培养基。,培养基的制备步骤,高压蒸汽灭菌 1、原理 利用

13、加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 一般培养基用0.1Mpa，121.5,1530min 2、步骤,加水,装待灭 菌物品,加盖,加热,灭菌时间到后 断电源,压力降为零 开箱取物,2)培养分离 步骤 2、富集所需菌种 配好的液体培养基用蒸汽灭菌15min后，在无菌操作下分装于数个已洗净并灭菌的100mL三角瓶中。 每瓶装培养基20mL，用洗净干燥吸液管分别取15mL矿水样加到三角瓶中，塞好棉塞置于2035恒温下，静置培养（或振动培养）710天。,细菌生

14、长繁殖使三角瓶中培养基的颜色由浅绿变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀。 选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取1mL培养液，接种到装有新培养基的三角瓶中，同样培养。培养液将比头一次更快的变红棕色。,按同样办法反复转移培养10次以上。每转移一次只需12滴，接种量逐渐减少而所培养的细菌却越来越活跃，只需培养35天就可把培养基中的Fe2+氧化为Fe3+。,培养的机制 在转移培养中，借助培养基的高酸度，可杀死淘汰掉一些不嗜酸的杂菌，同时由于培养基中的高浓度亚铁离子，只有氧化亚铁的细菌才能生长繁殖，其他菌则被杀死淘汰掉，而氧化铁硫杆菌则得到充分繁殖，活性越来越大。,氧化铁硫杆菌的检查和鉴定方法 肉眼观

15、察 如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿变成红棕色，最后产生高铁沉淀。 重铬酸钾容量法测定 测定培养液中亚铁变成高铁的数量。变化快的，说明细菌生长旺盛。 显微镜观察 观察细菌的形成，是否具有氧化铁硫杆菌的形状特征。 说明： 上述方法得到的菌种是不纯的，如要分离纯种，要作平板分离。,平板分离 方法 把配制好的固体培养基倒入培养皿制成平板。 在无菌操作下，用接种环取上述培养菌液在平板上划线分离，使所取菌液中的菌体细胞尽量沿划线分散开。 将划好的线培养皿在2530条件下恒温培养。,经10天左右，借解剖镜挑选适当菌落并用取样针转移到装有数毫升培养基的小试管中恒温培养，一般

16、7天左右培养液就可变成红棕色。 将此培养液重新在固体培养基上划线分离，如此反复进行数次分离和培养，就可获得纯菌株。,2. 平板划线分离法 将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙（约30）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后

17、放置接种架上。,图3-2 平板划线分离操作法示意图,3、浸矿细菌的驯化 1)影响细菌生长的因素 浸矿细菌的细胞膜类似于半透膜，可透过水分而对其他物质有选择性。细菌较其他生物细胞对渗透压的变化有较强的适应能力，但外界盐分浓度过高，会抑制细菌生长，甚至因渗透压变化过大，造成细菌死亡。,重金属离子可使细胞蛋白质凝固，大部分重金属离子对细菌有毒性作用，超过一定限度，细菌会因细胞脱水而死亡。 非金属离子对细菌影响小些，但浓度过高也不行。如F-，细菌对它很敏感，浓度超过几个ppm就会严重抑制细菌生长。,2)细菌的驯化机制 对细菌进行转移培养过程中逐渐变化外界条件，使对新环境不适应的细菌死亡，而某些活力较强

18、的细菌会发生变异，演变成耐受性更强的细菌而活下来，形成新在耐性菌株。,3）驯化方法 在装有一定体积培养基的三角瓶中加入较低浓度的金属离子后，接种入要驯化的细菌进行恒温培养，待细菌适应能正常生长后，将它再转移到含有更高浓度金属离子的培养基中继续培养。依此类推，每转移一次都提高金属离子浓度，最终可获得对该金属离子具有较强耐性的菌株。,4、细菌生长曲线 分成四个时期 生长缓慢期 对数生长期 稳定生长期 衰亡期 说明： 以上是所有微生物生长繁殖所必须经历的四个时期，每个时期的长短和细菌的活跃程度受环境因素制约。,生长缓慢期（延滞期） 当细菌由一个环境转移到一个新环境时，会出现一个逐步适应的缓慢生长期，

19、细菌生长繁殖速度很慢，细菌也不活跃。根据被培养细菌对环境的适应性，这个时期可能很短，也可能较长。 比较正常的情况是24周 如果在含硫化铜培养基中培养，一般要24周 如果细菌的养料不变，则转移当中的的缓慢期就很短，甚至没有缓慢期。,对数生长期 随着细菌适应环境后，生长非常活跃，以对数增长的速度繁殖，此时细胞数目大量增加，对数生长期的曲线斜率就是细菌生长率： 这个时期新增加的细菌数目远超过死亡的细菌数。,稳定生长期 细菌死亡数目和新生数目大致相等，总的细菌数维持恒定。这个时期培养器内细菌的绝对数是最多的。但此时培养基中营养大量消耗，细菌已变得不太活跃，当进入大量培养或用于生产接种时，应当使用稳定期

20、内尽量靠近对数期的细菌。 衰亡期 细菌开始大量死亡，培养器内总的细菌数目急剧减少。此时培养基中的营养物质已基本消耗完。,5、细菌的计量 比浊法 利用菌液所含细菌浓度不同，液体混合度不同，用分光光度计测定菌液的光密度的办法进行计算。将光密度大小与标准曲线对比，可以推知菌液的浓度。,直接计数法 利用血球计数器，取菌液样品直接在显微镜下观察计数。若测定单位菌液体积所含活菌数目，则须用平皿计数法和稀释计数法。,平皿计数法 将稀释后的菌液用固体培养基制成平板，然后在一定温度下培养，使其长成菌落，计算菌落数目，再乘以稀释倍数，则为所测菌液的活菌浓度。,稀释法 将菌液按10的倍数在培养基中连续稀释成不同浓度

21、，然后进行培养。观察细菌能够生长的最高稀释度，此最高稀释度培养液中的细菌数目为1个，则可按总的稀释倍数计算出原菌液内所含活菌的浓度，一般达到正常繁殖情况下菌液活菌浓度为1061010个/mL。,图5-1 Thoma血球计数板 A.正面图 B.纵切面图 1.血球计数板 2.盖玻片 3.计数室,16小格 25大格计数室,25小格 16大格计数室,图5-2 计数室的两种刻度形式,1、结果记录： (1)将计数结果记录下表。A表示五个中方格中的总菌数。B稀释倍数为102。,注:1 mL菌液总数=A/525104B=5107A,图7-1 连续稀释及倾注平板示意图,第四节 生物浸矿工艺,1、 微生物浸矿的实

22、验室研究方法 1）微生物浸矿的典型流程,破碎、与硫酸混合、堆放,通气,2）摇瓶试验 它是一种分批培养方法。在反应器中一次性加入培养基，然后接种并在一定条件下培养，浸出过程不再加任何物料，浸出结束后放出培养液处理。 3）微生物柱浸试验 无论浸出介质是否循环，柱浸可作为地浸、堆浸的实验室模拟。浸柱直径应大于矿石颗粒直径的10倍，浸柱高度至少应该是柱直径的5倍。,4）搅拌浸出试验 （1）半连续浸出试验 （2）连续浸出试验,微生物连续浸出实验装置 1-浸出反应器；2-调浆反应器；3-给矿机；4-矿浆收集器；5-矿浆,2、微生物工业浸矿工艺 随着大量低品位金属矿的堆积，近年来生物浸矿越来越吸引人们的注意

23、力。微生物浸矿方法有许多种，大致可以分为： 1）微生物地浸（原位浸出） 2）微生物堆浸 3）微生物槽浸和搅拌浸出,1）微生物地浸(就地浸出) 又称为原位浸出、原地浸出或溶浸采矿，是从低品位残留矿床或未开采的矿床中不用采矿作业回收金属的一种方法。 这种浸出在矿体中直接进行，在开采完毕的场所和部分露出的矿体上浇淋细菌溶浸液，或者在矿体上按设计好的位置钻孔至金属矿体，然后将浸矿菌液注入孔中，浸矿剂在多孔的金属矿体中循环，最后经生产井用泵将浸出液抽到地面并回收。 这种方法的优点是，矿石不需要开采选矿，可节约大量人力和物力，减轻环境污染。 缺点是：浸出液的流动性差、矿石与菌液接触面积小。,含金氧化矿体的

24、原地浸出示意图,2）微生物堆浸 此法通常利用斜坡地形，把低品位矿石堆积在矿坑外，从底部开始以阶梯形式堆积起来，并整平其上部。从上部喷射含菌浸出液，在低处建集液池收集浸出液。随着浸出的进行，浸出矿物的金属离子含量逐渐下降，此时在上部重新设置堆积层继续进行浸出。 为提高浸出后的浸出液的集水率，堆积场的地表要具有不透水性。 某些情况下，可在矿堆内铺设管网以保证矿堆的通气。,矿堆的尺寸结构的重要特性是控制其表面积与体积之比，以便能够保存细菌氧化硫化物所产生的热量，并使矿堆的作业不因外界温度低而受到显著的影响。一般6-10m高。 可用喷淋、浸渍或竖管将浸液引入矿堆，方式的选择取决于气候条件、矿物组成、矿

25、堆高度和表面积以及生产规模。 美国等国家实施大规模浸出的矿山中，有的堆积阶梯总高度可达300m。 堆浸是从硫化矿矿石中快速提取金属的有效方法。该工艺的特点是：规模大、浸出时间长，成本低。 这种方法常占用大面积地面，所需劳动力较多，但可处理较大数量的矿石，一次可处理几千至几十万吨。,按原料不同，堆浸可以分为原矿堆浸(heap leaching)和废石堆浸(durnp leaching)。 将低品位矿石破碎到一定粒度后进行堆浸称为原矿堆浸(Heap Leaching); 将含金属尾矿石不经过破碎直接堆浸称为废石堆浸(Dump Leaching)。 智利的Quebrada Blanca矿山采用的就是原矿堆浸工艺;BaiaLey矿山则采用了废石堆浸工艺。,微生物堆浸工艺流程示意图,生物堆浸步骤: 1、将粉碎的矿石（1-4cm）堆积于由塑料材料围起的堆浸场中。 2、用含细菌和细菌营养物的稀释过的硫酸溶液喷淋。3、溶液从矿堆中浸出、回收并不断喷淋。 4、金属从富含金属硫化物的矿石中浸出进入溶液，将溶液重新喷淋矿堆之前，采用传统方式回收金属。 由于堆浸中矿石颗粒比较大，通常大于6.5微米，因此回收率比采用装有搅拌器和通风装置的罐浸出要低。因此，生物堆浸通常用于制造精矿在经济上不可行或矿石在冶金上不可能被精化的矿床。,微生物氧化难浸金矿的堆浸工艺流程,3)槽浸或称搅拌浸出 是一种渗滤浸出，