网上培养caco-2经验总结

1、上海细胞生物所。还有我们实验室也有，不知道卖不卖。如果需要和我e-mail联系：hui_ 求助：有谁培养过HepG2细胞 和 Caco-2 细胞 吗？ 细胞, 培养, 求助细胞, 培养, 求助欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！ 本人第一次养细胞，目标细胞是HepG2细胞 和 Caco-2 细胞，现在在查文献，可是有不少东西都不懂，如我在网上找到的Caco-2 细胞的培养基是MEM,20%胎牛血清和NEAA，这个？没有量啊，到时怎么配呢？ 请养过这两种细胞的前辈指点经验啊！我在此多多感谢了！ 本帖最后由 liushen 于 0

2、8-6-16 22:13 编辑 超级版主3# 发表于 08-6-18 16:19 | 只看该作者 -MEM，胎牛血清，非必需氨基酸欢迎您访问。 提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！ MEM是一种细胞培养液，你可以去公司网站去查，有卖的。有现成的MEM液体，也有MEM干粉，可以自己去配制。 20%胎牛血清，就是在MEM液体里面加入胎牛血清至终浓度为20%。 NEAA是非必需氨基酸吧。我们用的是Gibco公司的产品，买来的时候是10倍浓度的，用的时候10倍稀释到培养液中即可。 我有養過 用DMEM+ FBS10% 含PS 0.05% 然後用trypsin 0.25%

3、 去做subculture 就可以了!很好養!窗体顶端窗体底端 trypsin subculture 10倍浓度的，用 MEM是一种细胞培养液 下 埃 各位前辈指点一下啊 本帖最后由 量啊，到时窗体顶端窗体底端Caco-2细胞培养的一点重要经验这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述,又不懂的可留言问）,对生长的空间问题要求比较高。在每一次传代消化的时候,要消化足够长的时间,要不停地在镜下观察细胞的消化状态。这个细胞长的比较厚,所以消化比较困难。需要耐心。而消化的结果应该是保证足够多的细胞都是成单个状态而不是抱团或者成片。对于这一点,常规消化是比较难做到的。

4、所以需要采取点特殊措施,我一般是这样做的：首先吸干净原培养基,加入少量含EDTA的胰酶（以下简称YE）润洗,快速润洗完细胞生长面后吸走,然后加入适量的YE（我个人一般较常用量多加0.5-1ml）,进行充分的消化,保持在镜下适时观察。待较多细胞被消化下来悬浮于消化液中,大部分细胞边缘皱缩变清晰后,用吸管吸出消化液入离心管中加入适量培养基,常规离心5分钟左右,离心完毕倾倒上清,加入新鲜培养基吹打均匀,然后置于新的小培养瓶中培养。原培养瓶中加入培养基吹打,细胞吹下来之后,适当多吹打几次细胞悬液以使细胞单个分离均匀。然后分瓶传代,原瓶加入新培养基继续培养。很关键的一点就是将YE的消化细胞悬液加培养基离

5、心后培养,这里面的细胞基本上都是被消化下来的单个单个细胞,Caco-2细胞单个单个的生长会比抱团的生长的好很多。传入新的培养瓶中之后你可以与原瓶进行比较。caco-2细胞培养遇到的麻烦。最近从上海细胞库引进一株caco-2（ATCC新引入，大概十代左右吧），在培养中遇到了不小的麻烦，所以来园子里问问各位达人。简述一下我的操作吧：收到细胞以后，在孵箱里搁了一夜。第二天，换液（自配的培养基：DMEM 20 Gibco NCS 0.1mM EME），同时留一份自带的培养基；一天后，消化，吸去培液后，加PBS洗一遍（居然给冲下来一块细胞.很诡异），去PBS后再加入0.25 Trypsin 3ml，室温

6、放置5min，镜下观察细胞仍粘连；去除大部分Trypsin后，放入孵箱，10min.20min.后，仍有相当数量的细胞紧密连接；加培养终止后，发现大部分细胞冲不下来；再进行第二次消化10min，总算能冲下细胞，且基本为单个。传了两盘，一份加自配的培液，另一份加随细胞自带的培液。一天后，观察：细胞贴壁的不多，且细胞碎片较多，换液处理（干净多了，呵呵）；两天后，观察：原来贴壁的细胞也死了不少，可能有密度依赖吧，稀了长不起来.很头痛！说明几点情况：1.这次是火车运送（奥运的原因.），路上耽搁了三天吧；2.0.25 Trypsin自配，用于消化其它的细胞，都没有问题；3.没有染菌的迹象，呵呵.高手们，

7、给点意见吧，谢过先！ 消化时间也太长了吧，可以试试消化一段时间后弃去培养基，然后拍打瓶子底部，看看细胞是否脱落，要不就买带EDTA的胰酶试试，消化时间太长，对细胞损伤很大 可用细胞刮子来刮，细胞消化太久不好的。不过caco-2算是比较好养的，消化个30min也不见得死，因为长的太结实了，细胞有融合，一定要消化成单个没什么意义。置于pbs冲洗脱落是很正常的，长成地毯状的细胞是容易被成片冲洗下来的，所以，培养基，pbs要预热，顺边缘加入，然后晃晃培养板。动作要轻。还有一点，有点担心，你的血清浓度是不是太高了。我曾经用FBS10%（gibco），没问题，后来省钱，用了20%NBS，国产，就出现了很多

8、网页上说的黑胶虫，麻烦的要死，细胞虽然状态不差，但是我还是全扔掉了，所以，建议你降低血清浓度，最好用胎牛。 感谢frankcai大牛的指教！细胞刮，没用过，感觉太“粗暴”了吧._，好使么?至于想消成单细胞，主要是觉得让一团细胞粘在一起，不利贴壁，可能会卦掉吧？试剂预热，我一般只是让它平衡到室温而已，偷懒呵呵至于血清，我主要是参考了园子里的评论细胞库网页ATCC，可能20保险一点吧，刚引进的细胞嘛.谁都知道Gibco的FCS好，可是所有细胞都用的话，负担不起咯主要是，我觉得控制不好消化的分寸，郁闷。 前段时间我在养Caco，也是中科院买的，Caco不太好培养。要用胰酶-EDTA（要预热）消化的，

9、25ml培养瓶加新鲜配置的消化液0.8ml，培养箱37度放2分钟。有时候这个细胞是不太好消化，细胞养了几代之后稳定了，应该还是比较好消化的。Caco贴壁比较慢，所以一定要去除胰酶-EDTA，要用一次性培养瓶。高糖DMEM培养基添加10%血清（FBS、NBS无所谓）。一两天内细胞贴壁形态不明显，两天之后才能看到细胞贴壁成块状，之后1-2天细胞生长迅速，4天差不多可以传代。祝好运! 楼上的为什么要用一次性培养瓶啊，我们养的发现玻璃瓶比一次性的一直都长的好些，虽然细胞普遍长的不好 谢谢summityoung！摸索摸索咯 我养的时候觉得Caco细胞用玻璃瓶养养，贴壁不好。 丁香园：ATCC建议用MEM

10、+20%FBS，细胞长得也不快，1：4传代需要5-7天才可以传下一代。但是，细胞会出现很多分泌物，看上比较脏，形态不好看。如果你使用Gibco血清时，可以用逐渐降到10FBS，一则省血清，二则减少细胞分泌物。国产血清就别省了吧。国内的Caco-2细胞被驯化过了，可以在10FBS的条件下长得不错。如果你是从中科院购买细胞，你可要注意了，尤其是使用进口的好血清时，一定要用10FBS养，千万别用20FBS，否则细胞会疯长。个人认为，一、血清的多少对Caco-2的结果有影响的，一定要注意血清比例。二、Caco-2不应该长得很快，一般5-7天传一代比较好。三、那些认为Caco-2好养的人要注意了，如果你

11、的细胞长得比较快的话，可能是血清的原因，也可能你的细胞已经不是Caco-2了。电阻仪，太贵了，但又是必备阿Caco2 细胞单层模型的评价：1、细胞形态学(小肠微绒毛结构及细胞间紧密连接) ; 2、小肠刷状缘细胞标志酶碱性磷酸酶的活性;3、Caco2 细胞单层的跨膜电阻( transepithelial electrical resistance ,TEER) ; 4、漏出标志物(甘露醇、荧光黄等) 被动扩散的跨膜通量;培养时普通培养瓶就好，等到做药物穿透性试验时才需要铺在TRANSWELL板上，卖得公司挺多的，我们用的是MILLIPORE的电阻仪好贵啊，打算用LC/MS测甘露醇ATCC培养方法

12、师姐教我这样做：1）弃旧培养液，2）PBS洗2-3遍，弃去，3）加入适量消化液，50ml瓶我加入800ul，盖好盖子放进培养箱约3min，4）3min后从培养箱取出培养瓶，在倒置镜下观察，大多数细胞已变圆，弃去消化液，室温下让残留消化液继续作用，5）隔几分钟轻轻拍打瓶壁，待细胞从瓶壁上脱落时，加入适量完全培养基中止消化作用，用吸管轻轻吹打即可，6)将消化下来的细胞转至离心管进行离心，1000rpm，5min，7）取出离心管，弃去上清液，加入1ml新鲜完全培养基，充分混匀后分瓶。Caco-2对营养，对血清的要求较高，如果你传代后成团，挤着生长，而且你用的是国产血清，试试换成进口的吧，我以前用四季

13、清的，就是你这样情况，总是长不开养不活，换成GIBCO状态就好了，还有，培养液10%的血清比例要足够，传代时培养基体积尽量多点也没关系的。大家如果感兴趣，可以在园子里搜索一下我对于Caco-2问题的一些解答和建议，希望能有帮助，在这里把大家在这个帖子里的问题逐一解答一下。1. 对于传代的问题，理论上来讲如果Caco-2细胞不超过70代，形态和功能上一般不会发生太大的变化。但是如果你是用来做实验，一个批次的实验最好控制在10代以内，如果还想做就要重新复苏细胞，因为已经传了10代了，可能会有一些变化。2. 对于消化，既然Caco-2细胞属于贴壁细胞，消化的标准是大部分细胞碎片脱落，在此期间可以对其

14、进行轻微震荡，消化下来后用一到两倍的培养基中和胰酶的作用，然后吹散，这一步也很必要。3. 中和结束后离心，弃去上清后再加入新的培养基。一般传代的话一分五就行，也就是如果用5毫升培养基重悬细胞，取出1毫升传代就行，当然要视密度和生长状况而定。4. 楼主说的吹打100次太多了，如果你用移液管吹不散的话，可以用1毫升的移液枪试试，那个力度更大，大概有十几次应当就没有问题了。5. 对于培养基，一般是采用DMEM，而且要加入10 mM的HEPES，主要作用是稳定pH值，别忘了加，要不然变化很大的。jyhuang123所说的培养基变紫了，不是不稳定分解，而是pH值发生了变化。6. 对于jyhuang123

15、的另外一个问题，“很多不贴壁的都在换液的时候吸掉了”，这个是无所谓的。如果细胞经历24小时仍然没有贴壁，那证明细胞没有长好，长好的肯定已经贴上了，没贴壁的那些肯定状态不好，所以不要也不可惜。7. contala的新问题是铺板，那个就要注意了，就是铺上后和最初几次换液，尽量避免摇晃，因为晃一下的话很容易将细胞都晃到中间而聚团。大家再接着努力吧，看看有什么问题再讨论。我去年从上海细胞库买回来是也是按照他们标示用的1640,后来换成高糖DMEM，一直养到现在，没有问题，这种癌细胞还是非常好养的！传代最好不要等它长的太满传，大概80-90%就可以传了，太满再传后反而状态不好了。caco-2（人结肠癌上

16、皮细胞）：将Caco-2 细胞培养于高葡萄糖的DMEM培养基中( 1%非必需氨基酸, L-谷氨酰胺（L-glutamine), 培养液含青霉素（ penicillin）10,000U/ml-链霉素（streptomycin）10,000ug/ml, 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS)）,长于T-75组织培养曲颈瓶中,通入5%CO2(相对湿度90%),置37培养箱中培养。培养介质23天更换一次,当细胞达到90%融合后，以不含钙,镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后与胰酶(0.25%)EDTA(1mM)于37一起孵育至分离(约510分钟)。吹打细胞使之脱落，置离心管中1

17、000rmp离心5分钟。细胞重新悬浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培养瓶中。即完成传代。文献上都是把细胞种在transwell上养14天以上，我种在普通六孔板上，按文献上24孔板每孔4*104的数量折合后接种，第五天融合后就出现空泡，和细胞的叠合，脱落坏死，随着时间的延长，脱落的越来越多，感觉像是被挤死了。问题是普通细胞培养板和transwell有区别吗？是种在transwell上就会不存在这个问题？还是我种板技术有问题？1、 如果细胞传代就生长不行你可以考虑用进口一次性塑料培养瓶；2、使用新购买的血清培养细胞生长好的情况下可考虑多购买几瓶同一个批号的备用（试验表明冷冻保存放23年没

18、有啥变化）；3、PH不用调节，在配制培养基时候一般都加入HEPES来平衡酸碱度。培养时候肉眼观察即可估计出PH值，因为本身培养基含有酚红指示剂，细胞多的时候为黄色（酸性），细胞很少为红色（碱性），加上有5%CO2控制不用考虑酸碱再次调节；4、培养基可考虑重新配制后再培养观察生长情况，期间要考虑生长为星星点点的是不是有细菌或霉菌污染的情况。总之，试验是要靠你自己去具体分析，以上仅是个人意见仅供参考。2、 Caco-2在国外基本上已经属于玩烂了的模型了,国内现在也很流行.基本上大的药学院都有老师在做.至于费用,那要看你们现有的条件了,如果已经有常规的细胞培养室的话.花费上1个12-WELL的TRA

19、NSWELL大概人民币100多吧,电阻仪贵点可能不到10K.其他常规耗材和培养液用不了太多钱吧.如果你要用C14-MANNITOL估计还要加上千八百的样子吧.caco-2（人结肠癌上皮细胞）的传代2008-08-24 00:00 来源：丁香园 点击次数： 598 关键词： caco-2 人结肠癌上皮细胞 传代 将Caco-2 细胞培养于高葡萄糖(的DMEM培养基中( 1%非必需氨基酸， L-谷氨酰胺（L-glutamine)， 培养液含青霉素（ penicillin）10，000U/ml-链霉素（streptomycin）10，000ug/ml， 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS)），长于T-75组织培养曲颈瓶中，通入5%CO2(相对湿度90%)，置37培养箱中培养。培养介质23天更换一次，当细胞达到90%融合后，以不含钙，镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后与胰酶(0.25%)EDTA(1mM)于37一起孵育至分离(约510分钟)。吹打细胞使之脱落，置离心管中1000rmp离心5分钟。细胞重新悬浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培养瓶中。即完成传代。 我在