试验十二常用血细胞化学染色

1、实验十二 常用血细胞化学染色Cytochemistry stain for blood cells一、过氧化物酶染色染色原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。试剂器材11%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。2亚硝基铁氧化锅饱和溶液 在少

2、量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。31%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。4稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。5瑞氏(Wright)染色液。6新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。操作步骤1取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10L，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。2在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。3自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染1520 min。4自来

3、水冲洗，待干，用油镜镜检。注意事顶1血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。2TMB配制在85%88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。3H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。4染色液pH应为5.5。5试剂应置于低温暗处，防止因光线照射而失效。实验评价1POX染色是鉴别急性白血病类型最重要最常用的细胞化学染色方法，临床上不管是哪种急性白血病，首先做POX染色，以区分是急性髓细胞白血病还是急性淋巴

4、细胞白血病。如变异型的急性早幼粒细胞白血病极易误诊为急单、急粒中如以小型原粒细胞为主者极易误认为急淋等。在判读细胞POX染色结果前，要先观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染色是否成功。2POX阳性说明是急性髓细胞白血病(阳性较强常见于急性粒细胞白血病，弱阳性常见于急性单核细胞白血病)；阴性说明各种急性白血病的可能性均有。因原始细胞多表现为阴性反应，故本法对白血病的分型有一定的局限性，特别是对某些分化极差的白血病，可能失去鉴别意义。3四甲基联苯胺法操作简单，染色效果较好，试剂无致癌作用，但对染液pH要求较高，如pH5.0会导致假阳性结果。二、氯乙酸AS-D荼盼醋酶染色染色原理血细胞内的氯乙酸AS

5、-D荼酚酯酶(naphythol AS-D chloroacetate esterase, NAS-DCE)水解基质液中的氯乙酸AS-D荼酚，产生AS-D荼酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。试剂器材110%甲醛甲醇固定液甲醛 25mL甲醇 75mL混合后置4冰箱保存。2Veronal醋酸缓冲液甲液：醋酸钠(含3H2O) 1.94g巴比妥钠 2.94g蒸馏水 100mL乙液：0.1mol/L盐酸 取盐酸(比密1.190g/L)0.85mL加蒸馏水至100mL。取甲液50mL，乙液45mL，再加

6、蒸馏水135mL，用1mol/L盐酸调pH至7.57.6。3基质液氯乙酸AS-D荼酚 100mg丙酮 0.5mL蒸馏水 5mLVeronal醋酸缓冲液 5mL固酱紫GBC盐 10 mg不必过滤立即染色，一次用完。4苏木素染液。操作步骤1固定 新鲜干燥的涂片在固定液中30 s1min，蒸馏水冲洗，待干。2显示 放入基质液(37)30min，自来水冲洗。3复染 苏木素染液复染5mn，自来水冲洗，待干，镜检。注意事顶1冬季室温低，茶酚和固酱紫GBC盐不易溶解，可放37温箱促溶。2茶酚在丙酮中溶解后再加其他液体。3NAS-DCE不被氟化钠抑制。4此酶染色后的标本易脱色，不能长期保存。实验评价NAS-D

7、CE阳性反应几乎仅出现在粒细胞、较POX染色更具有特异性，因此又称为粒细胞酯酶、特异性酯酶。故该酶较特异地识别粒细胞系，有助于急粒和急单的鉴别，特别是对某些POX反应较强的单核细胞白血病鉴别意义更大。三、一醋酸荼盼醋酶染色染色原理血细胞内的-醋酸荼酚酯酶(-naphythyol acetate esterase,-NAE)在pH中性的条件下可水解基质液中的-醋酸荼酚，释放出-荼酚与基质液中的重氮盐偶联形成不溶的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐对坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色。-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶。单核系细胞的阳

8、性可被氟化钠抑制，所以做-NAE染色时，通常同时做氟化钠抑制试验。试剂器材10.067mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)。甲液：Na2HPO412H2O 2.388g加蒸馆水至100mL。乙液：KH2 PO4 0.908g加蒸馏水至100 mL。取甲液87mL，乙液13mL混合，调pH至7.6。2基质液0.067mol/L磷酸缓冲液50 mL，加10g/L-醋酸荼酚(用50%丙酮为溶剂)1.0mL，充分振荡，直至最初产生的混浊物(大部分)消失为止，加重氮盐(坚牢蓝B等)50mg，振荡，过滤后立即使用。310 g/L甲绿水溶液。操作步骤1固定 新鲜干燥涂片置10%甲醛生理盐水中5min，自来水冲

9、洗5min，待干。2显示 放入基质液(37)1h，自来水冲洗。3复染 l0 g/L甲绿水溶液复染515min，自来水充分冲洗，待干，镜检。4氟化钠抑制试验 在1mL基质液中加入1.5mg氟化钠，其余按本染色法进行，染色步骤同上。注意事顶1标本必须新鲜，应于取材后两天内染色。2重氮盐的选择依次为坚牢蓝B、坚牢蓝RR及坚牢黑B的染色效果为好。实验评价1-NAE染色是一种非特异性醋酶染色，是判断急性白血病的常规染色方法，在中性pH时用-NAE作底物，正常单核细胞和原始单核及幼稚单核细胞均呈阳性反应，不被氟化钠抑制；其他血细胞则呈阴性或弱阳性反应，故-NAE又称单核细胞酶，结合氟化钠抑制试验，对鉴别单

10、核细胞白血病有重要价值。2有时单系细胞或粒系细胞、淋系细胞阳性较弱，因此难以判断加氟化钠后的抑制情况，且有时阳性细胞是由于假阳性所致。四、过碘酸-雪夫染色染色原理过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基(-CHOH-CHOH)的多糖类物质(糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白及糖酯等)氧化，形成双醛基(-CHO-CHO)。醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使其变成紫红色，定位于细胞内的多糖所在处。在过碘酸氧化前，用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本，再糖原染色，可鉴别是糖原还是其他多糖类物质，如被消化则是糖原，如不被消化则为其他多糖类物质。过碘酸-雪夫反应(periodic acid-Schiff reaction

11、, PAS),以前又称为糖原染色。试剂器材1l0g/L高碘酸溶液HIO42H2O 1g蒸馏水 加至100mL2.雪夫染液 取蒸馏水200 mL加人500 mL容量的三角烧瓶，加热至沸。移开火焰，缓慢加入碱性品红1g，继续加热2min，使之充分溶解后停止加热。冷却至60左右时，过滤，加入1mol/L盐酸20mL，混匀。待冷却至25加入偏重亚硫酸钠(Na2S2O5)2g混匀，置带塞的棕色玻璃瓶中，放暗处24h后加活性炭1g，振荡混匀吸附色素，用滤纸过滤后密封在棕色瓶内，放冰箱保存。3亚硫酸液100g/L偏重亚硫酸钠 6mL1mol/L盐酸 5mL蒸馏水 100mL每次用前新鲜配制。420g/L甲绿

12、甲绿 2g蒸馏水 加至100mL5淀粉酶 嚼石蜡刺激分泌唾液，收集唾液离心取上清液，内含淀粉酶，将麦芽糖淀粉酶0.11.0g溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)100mL中。操作步骤1固定新鲜干燥的涂片用95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗，待干。2如涂片需要消化，可加唾液或麦芽糖淀酶，置室温消化60 min，然后用蒸馏水冲洗。310g/L高碘酸氧化1520min，蒸馏水冲洗，待干。4置雪夫染液中室温染色3060 min。5用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用自来水冲洗23min，待干。620g/L甲绿复染1020 min。7水洗，待干，镜检。注意事顶1所用染色缸及器具应十分清洁、手燥。

13、2固定试剂不同，染色效果不同。目前较常用的有95%乙醇、纯甲醇及甲醛蒸气，其中乙醇固定后糖原颗粒明显，各成熟粒细胞的反应有较明显的颜色差异，易于判断阳性反应的程度，且唾液消化后的对照标本没有假阳性，故通常选用乙醇为固定剂。310 g/L高碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用，氧化时间要准确，否则将导致假阳性或假阴性。4碱性品红试剂对染色的影响不同品牌的碱性品红染色效果不一，碱性品红的质量是试验成败的关键因素之一。雪夫(Schiff)染液应避光保存，无色，变红则失效。5染色后标本应及早观察和记录，染色后标本保存8天后，将逐渐褪色，保存时间延长，褪色更为明显。实验评价1不同疾病血细胞的PAS染色呈不同

14、程度的阳性反应，它在诊断恶性红细胞系疾病中最有价值(尤其是强阳性)；但要注意的是恶性红细胞系疾病并不都是阳性，良性红细胞系疾病也并不是全为阴性。2PAS染色在鉴别急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病中作用不大，而在诊断淋巴细胞白血病、鉴别脂质代谢障碍等疾病有一定价值。五、中性粒细胞碱性磷酸酶染色染色原理中性粒细胞碱性磷酸酶染色的方法有Gomori钙-钻法和kaplow偶氮偶联法，因为钙-钻法操作较为繁琐且所需时间长，偶氮偶联法的试剂盒操作方便，染色时间短，故目前国内常用偶氮偶联法，下面介绍该方法的原理。kaplow偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilic alkaline

15、phosphatase, NAP)在pH 9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸荼钠底物，释放出荼酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。试剂器材110%甲醛甲醇固定液甲醛 25mL甲醇 75mL混合后置4冰箱保存。2丙二醇缓冲液(1)贮备液(0.2mol/L)2-氨基-2甲基-1,3-丙二醇 10.5g 蒸馏水 加至50O mL溶解后保存冰箱内。(2)应用液(0.05mol/L，pH 9.75)0.2mol/L贮存液 25mL0.1mol/L盐酸 5mL蒸馏水加至 100 rnL3基质孵育液(pH9.59.6) -磷酸荼酚钠20mg溶于0.05mol/L

16、丙二醇缓冲液20mL，再加坚牢紫酱GBC盐(或重氮坚牢蓝)20mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。41g/L苏术素复染液 取1g苏木素加到蒸馏水500mL中，加热煮沸，使苏木素溶解，再加入蒸馏水500mL、碘酸钠200mg、硫酸铝钾50g，充分混匀，置棕色玻璃瓶中室温保存，使用前过滤。操作步骤1固定 新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗3060s，待干。2显示 把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育1015min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。3复染 置苏木素复染液复染58min，蒸馏水冲洗12min，待干，镜检。注意事顶1坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是NAP染色成败

17、的关键。2基质孵育液必须临用前新鲜配制。3所用的片子要新鲜。固定后，一般在一周内进行染色。做NAP染色时，最好选择其他患者的片子做阳性对照。4NAP染色以阳性率及积分报告结果。实验评价1本法较钙-钻法简便、快速，色彩鲜艳，结果准确。2临床上NAP染色应用较广泛，但受主观因素影响较大，因此参考值变化较大。所以,NAP积分明显增高或明显减低者才有临床意义，同时要排除生理性影响(如年龄、性别、应激状态、月经周期、妊娠及分娩等)。六、铁染色染色原理正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。试剂器材1酸性

18、亚铁氰化钾溶液200g/L亚铁氰化钾溶液 5份浓盐酸 1份取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓滴加浓盐酸，边滴边摇匀，待烟雾消失后，过滤备用。22g/L核固红-硫酸铝溶液，取硫酸铝2g溶于100mL蒸馏水中，再加入核固红0.2g。置37水浴中1h并随时振荡使其溶解，过滤后备用。操作步骤1固定干燥骨髓涂片用甲醇固定10min，待干。2显示玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37染色30min蒸馏水冲洗。3复染置核固红液染1015min。流水冲洗，待干，镜检。注意事顶1玻片需经去铁处理将新玻片用清洁液浸泡24h，取出后反复水洗，浸入95%乙醇中24h，晾干，再浸泡在5%盐酸中24h，用双蒸气反复浸洗玻片，取出烤干后备用。2骨髓取材要满意，做细胞外铁时一定要有骨髓碎块或颗粒，取材不佳时，往往影响结果判断。3酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。实