吨螺旋霉素发酵生产工艺设计

1、目录目录 引言.- 2 - 1 菌种的选育.- 3 - 1.1 材料与方法.- 4 - 1.1.1 出发菌株.- 4 - 1.1.2 培养基与培养条件.- 4 - 1.1.3 发酵效价测定.- 5 - 1.1.4 诱变处理.- 5 - 1.1.5 豆油耐性变种的选育.- 5 - 1.1.6 缬氨酸诱导变种的选育.- 5 - 1.2 预计结果.- 5 - 1.2.1 豆油耐性变种的选育.- 5 - 1.2.2 缬氨酸诱导变种的筛选.- 6 - 1.2.3 菌株 XC 4-18 的遗传稳定性.- 6 - 1.2.4 菌株 XC 4-18 与菌株 XC 1-19 的生产水平比.- 6 - 1.3 原

2、因分析.- 6 - 2 种子的扩大化培养.- 6 - 2.1 孢子制备.- 7 - 2.2 种子制备.- 7 - 2.3 种子培养.- 7 - 2.4 种子质量的控制.- 8 - 2.5 种子质量的控制措施.- 8 - 3 培养基的设计.- 8 - 3.1 碳源.- 9 - 3.2 氮源.- 9 - 3.3 无机盐和微量元素.- 9 - 3.4 生长因子.- 10 - 3.5 水.- 10 - 3.5 前体物.- 10 - 4 灭菌.- 10 - 4.1 连续灭菌流程及设备.- 11 - 4.1.1 流程的选择.- 11 - 4.2 连续灭菌的操作.- 12 - 4.3 连续灭菌的计算.- 1

3、3 - 5 空气除菌.- 14 - 5.1 空气预处理与设备.- 15 - 5.2 油水分离与设备.- 15 - 5.3 生产规模设置.- 16 - 6 发酵过程中的控制参数.- 17 - 6.1 发酵主要操作方式.- 17 - 6.2 发酵过程中的代谢变化参数.- 18 - 6.2.1 物理参数.- 18 - 6.2.2 化学参数.- 19 - 6.2.3 生物参数.- 20 - 6.2.4 发酵终点的判断.- 20 - 7 相关计算.- 21 - 7.1 发酵罐的工艺尺寸.- 21 - 8 下游加工.- 23 - 8.1 发酵液预处理.- 24 - 8.2 过滤.- 24 - 8.3 醋酸

4、丁酯提取.- 24 - 8.4 水洗.- 25 - 8.5 水提.- 25 - 8.6 脱丁酯.- 25 - 8.7 结晶.- 25 - 8.8 产品检测.- 26 - 8.9 干燥包装.- 26 - 参考文献.- 26 - 年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计年产三百吨螺旋霉素发酵生产工艺设计 引言引言 螺旋霉素，英文名 Spiramycin。白色或微黄色粉末，微有味；微吸湿； 易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，难溶于水。具有强大的体内抗菌作用和抗菌 后效应（PAE） ，能够增强吞噬细胞的吞噬作用，广泛分布于体内。本品在组织 细胞内浓度较红霉素高，而副作用小于红霉素。可用于治疗由革兰阳性菌和某 些

5、革兰阴性菌引起的耳、鼻、喉和呼吸道感染。该品系多组分大环内酯类抗生 素，作用机制、抗菌谱与红霉素相似，抗 肺组织菌作用与红霉素相似或略逊， 但比其具有更长的抗生素后效应（PAE） 。与红霉素有交叉耐药。对革兰阳性菌 和一些革兰阴性菌如链球菌、脑膜炎双球菌、百日咳杆菌、梭状芽胞杆菌等包 括对青霉素、链霉素、四环素、氯霉素耐药菌均有效。对立克次体等有效。 在抗感染药物市场中，大环内酯类抗生素和头孢菌素类、喹诺酮类、青霉 素类一起，成为四大主力军团。而螺旋霉素及其衍生物长期以来一直占据 35% 左右的大环内酯类抗生素市场份额，正处于销售成熟期。全国有螺旋霉素及其 衍生物的制剂生产企业近 100 家，

6、有稳固的市场，有固定的销售渠道，有叫得 响的品牌，有价格低廉的优势，相信今后市场销售额还会稳步上升。 后市发展潜力巨大：目前，我国仍为发展中国家，13 亿人口的人均年用药 金额不到 10 美元，与发达国家 60 美元100 美元的用药水平相比差距很大。 今后，随着人民生活水平的逐步提高，医疗保障体系的日趋完善，对药品的总 体需求还将不断扩大，医药市场这个蛋糕必将越做越大，螺旋霉素及其衍生物 市场销售额也必定水涨船高。 1 1 菌种的选育菌种的选育 螺旋霉素的产生菌是生二素链霉菌(S.azmbo-faeiensis),在合成培养基上 气生菌丝生长快,白转灰色,基内菌丝为微黄色至微灰色,可溶色素淡

7、黄褐色。孢 子丝长,螺旋霉素形,松紧不一,孢子卵圆至球形。国产链霉菌新品种 L799,其孢 子长方形,孢子表面有疣状凸起并带有粗短小刺。在大多数培养基上产生菌丝淡 紫灰,基内菌丝呈葡萄紫。其孢子形成慢且不易保藏,因此要选择适宜的保藏方 法和条件,以保证孢子的存活率。 菌种选择：本设计采用的是中国微生物资源库菌种保藏中心的产二素链霉 菌链霉，在实验室其发酵效价可达到 15003000u/mL。 根据螺旋霉素的生物合成途径对螺旋霉素产生菌产二素链霉菌进行推理选 育, 并获得了高产菌株。首先在紫外线诱变的基础上,筛选豆油耐性变株得到菌 株 XC 2-37, 其发酵效价较出发菌株 XC 1-29 提高

8、 9%。通过培养基优化, 菌株 XC 2-37 的发酵效价提高 61.8% 。再以紫外线处理菌株 XC2-37,并筛选缬氨酸 诱导变株, 得到菌株 XC 3-11,其发酵效价较菌株 XC 2-37 提高 20%。菌株 XC 3-11 经自然分 离得到菌株 XC 4-18, 发酵效价达到 4500u/ml,为原始出发菌 株 XC 1-29 的 2. 25 倍。传代试验表明菌株 XC 4-18 的高产遗传特性稳定。 菌株 XC 4-18 应用于 50m3发酵罐进行工业化生产，与原始出发菌株 XC 1-29 相 比,发酵效价和发酵指数分别提高 84.9%和 43.6%。 螺旋霉素 ( spiramy

9、cin, SPM )为十六元大环内酯类抗生素,其内酯环的生 物合成是由 5 分子乙酸、1 分子丙酸、1 分子丁酸和 1 分子未知前体(二碳单位)组 成。支链氨基酸,如缬氨酸等,经分解代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸, 作为 SPM 生物合成的前体。现根据 SPM 生物合成途径对 SPM 产生菌产二素链霉菌进行推 理选育,并获得了高产菌种。 1.11.1 材料与方法材料与方法 1.1.11.1.1 出发菌株出发菌株 产二素链霉菌( Strep tomy cesam bofaciens )XC 1-29。 1.1.21.1.2 培养基与培养条件培养基与培养条件 斜面培养基：含淀粉,豆饼粉,MgSO4，N

10、aCl,CaCO3 ,琼脂; 以温度 280.5,相对湿度 30%-50%，培养 12d。 平板培养基：含淀粉, KNO3,K2HPO4,MgSO4 ,NaCl，FeSO4,琼脂;培养条件同 斜面（以温度 280.5,相对湿度 30%-50%，培养 12d。 ） 。 种子培养基：含淀粉,豆饼粉,蛋白胨,玉米浆,KH2PO4,NaCl,CaCO3;以温度 280.5,220r/min 培养 40h。 发酵培养基：含淀粉，葡萄糖,玉米浆鱼粉，酵母粉, NH4NO3,KH2PO4,MgSO4,NaCl,CaCO3,豆油;以温度 280.5,接种量 8% ,220r/min 培养 96h。 1.1.3

11、1.1.3 发酵效价测定发酵效价测定 杯碟法,检定菌为藤黄八叠球菌 28001。 1.1.41.1.4 诱变处理诱变处理 将产二素链霉菌 XC 1-29 新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液，吸取 5ml 于无 菌平板中。置于波长 253.7nm，功率 30W，紫外灯之下 30m 处，开盖，震荡照射 60s。 1.1.51.1.5 豆油耐性变种的选育豆油耐性变种的选育 用豆油代替分离培养基中的淀粉, 将诱变存活孢子涂布于这一培养基上, 筛选豆油耐性变株(Oil)。 1.1.61.1.6 缬氨酸诱导变种的选育缬氨酸诱导变种的选育 将诱变存活孢子涂布在含 L-缬氨酸分离培养基中, 筛得缬氨酸诱导变种 (V

12、al)。 1.21.2 预计结果预计结果 1.2.11.2.1 豆油耐性变种的选育豆油耐性变种的选育 产二素链霉菌 XC1-29 经 UV 诱变后的存活孢子,适当稀释后涂布于含豆油 的平板培养基上,UV 诱变和不诱变孢子也分别稀释涂于不含豆油的平板培养基 上作对照。以上 3 组各挑一定量菌落移种斜面,经二级发酵后测定效价,比较 SPM 生产能力。 结果表明:豆油耐性变株的发酵效价高于自然分离株与 UV 诱变株其中豆油 耐性突变株 XC 2-37 的发酵效价较出发菌株 XC 1-29 提高 9%。通过培养基优 化，菌株 XC 2-37 的发酵效价又提高 6.8%. 1.2.21.2.2 缬氨酸诱

13、导变种的筛选缬氨酸诱导变种的筛选 以菌株 XC 2-37 为出发菌株，通过 UV 诱变处理，并在含 L-缬氨酸的平板 培养基上筛选缬氨酸诱导变种，UV 诱变和未诱变菌株作对照。 结果表明：缬氨酸诱导变株的发酵效价高于自然分离株与紫外诱变株。 其 中缬氨酸诱导变株 XC 3-11 的发酵效价较出发菌株 XC 2-37 提高 20% 。菌株 XC 3-11 经自然分离得到菌株 XC 4-18, 发酵效价达到 4500u/ml,比菌株 XC 3-11 提高 6.7% 。菌株 XC 4-18 的发酵效价是原始出发菌株的 2.25 倍。 1.2.31.2.3 菌株菌株 XCXC 4-184-18 的遗传

14、稳定性的遗传稳定性 用群体连续传代的方法考察菌株 XC4-18 的传代稳定性,其生产能力波动幅 度小, 说明菌株 XC 4-18 的高产遗传特性稳定。 1.2.41.2.4 菌株菌株 XCXC 4-184-18 与菌株与菌株 XCXC 1-191-19 的生产水平比的生产水平比 菌株 XC 4-18 与菌株 XC 1-29 应用于 50m3发酵罐的生产。菌株 XC 4-18 的发酵效价和发酵指数分别较出发菌株 XC 1-29 提高 84.9%和 43.6% 。 1.31.3 原因分析原因分析 螺旋霉素为大环内酯类抗生素,其内酯环由五个乙酸，一个丙酸，一个丁酸 和一个未知前体构成。在发酵培养基中

15、加入短链脂肪酸能刺激产二素链霉菌 SPM 的生物合成。都有分解能产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸, 豆油耐性 变种能提高菌株利用脂肪酸的能力, 因此能提高 SPM 产量。 缬氨酸等氨基酸代谢可产生乙酸、丙酸、丁酸,能刺激 SPM 的生物合成。 缬氨酸诱导变种能多产前体，导致 SPM 增产。 2 2 种子的扩大化培养种子的扩大化培养 工业生产规模越大，每次发酵所需的种子就越多。要使小小的微生物在几 十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大 的微 生物细胞才行。菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当 数量的代谢旺盛的种子。种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮

16、的菌体而且 还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。 的种子制备一般包括两个过程，即在 固体培养基上生产大量孢子的孢子制 备和在液体培 养基中生产大量菌丝的种子制备过程。 养基中生产大量菌丝的 种子制备过程。 2.12.1 孢子制备孢子制备 孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、 数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制 备工艺有其不同的特点。 霉菌的孢子培养，一般以大米、小米、玉米、 麸皮、麦粒等天然农产品为 培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类 培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为 25

17、28，培养 时间为 4 14 天。 2.22.2 种子制备种子制备 种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养， 使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 摇瓶种子制备：某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经 摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。摇瓶相当于微缩了的种子 罐，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。摇瓶种子进罐，常采用母瓶、子 瓶两级培养 种子罐种子制备：种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体 积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子，把 一级种子

18、转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。把一级种子转入发酵罐内发酵， 称为二级发酵。 螺旋霉素的种子制备需采用种子罐种子植被的方式，并采用二级发酵的方 式。 接种龄：接种处于对数期的细菌。 接种量：接种量定为 8%。 2.32.3 种子培养种子培养 种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条件和 培养方法，从而保证种子正常生长。工业微生物培养法分为静置培养和通气培 养两大类型。 液体深层种子罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以 促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然 扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为液体深沉培养。 其特点是容易按照生产菌

19、种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、 搅拌、温度与培养 基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。故采用液体深 沉培养法。 2.42.4 种子质量的控制种子质量的控制 培养基：与发酵罐中的培养基类似。因为是孢子培养，所以须去掉其中的 豆油，动物蛋白 NY 等，以使其成为单一氮源的培养基。 培养温度和湿度：要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄，必须保 证在最适范围。培养温度：28。查阅资料的其相对湿度应当保持在 40%50% 之间。 通气量：生二素链霉菌为严格的好养菌，因其采用的是二级种子发酵罐， 故通气量定为 1/1.5. 斜面冷藏时间：冷藏时间为不超过七到八天。 2.52.5 种子

20、质量的控制措施种子质量的控制措施 菌种稳定性的检查：取少量保藏菌种置于灭菌生理盐水中，逐级稀释，在 含有琼脂培养记得双碟上划线培养，菌液稀释度以双碟上所生长的菌落不至过 密为宜。挑选出形态整齐、孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力， 以不低于其原有生产活力为原则，并取生产能力高的菌种备用。 无杂菌检查：种子液显微镜观察，肉汤或琼脂斜面接入种子培养液进行无 菌试验和对种子液进行生化分析。其中无菌试验是判断杂菌的主要依据。 3 3 培养基的设计培养基的设计 发酵培养基成分为水、淀粉 7.0%、黄豆粉饼 1.5%、动物蛋白 NY0.5%、糊 精 1.2%、玉米浆 0.7%、碳酸钙、硝酸铵、氯化

21、钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸 铵等。根据螺旋霉素产生菌的代谢情况,在发酵 96 h 或 120 h,以 10.5 比例 补加营养物质提高发酵单位。 成分小罐%（g/mL） 黄豆饼粉 玉米浆 1.5 0.7 淀粉7.0 NaCl0.3 CaCO30.5 （NH4）2SO40.12 豆油0.8 糊精1.2 3.13.1 碳源碳源 凡是构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养并提供能量的物质均称为， 并提供能量的物质碳源。目前发酵培养基发酵生产中多用鱼粉或黄豆粉饼，黄 豆粉饼的优点是原材料质量稳定，染菌率低，但发酵效价相对较低，以鱼粉作 氮源发酵效价相对较高，但鱼粉质量质量不稳定。发酵条件研究发现:不同

22、碳源 中以淀粉最好,糊精次之,最差是蔗糖和乳糖;不同氢源中以鱼粉最好,辅加氢源 中以硝酸铁最好。对培养基进行改进，在黄豆粉饼中加入动物蛋白 NY，提高发 酵水平。 3.23.2 氮源氮源 凡是构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质均称为氮源，氮源可分 为有机氮源和无机氮源。上文提到的动物蛋白 NY,以及黄豆粉饼和一些无机氮 源，如硝酸铵。 3.33.3 无机盐和微量元素无机盐和微量元素 无机盐（mineral salt）和微量元素(trace element, microelement)是 生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用，磷（核酸） 、硫、铁（细胞色素） 、镁、钙（调节细胞膜透性）

23、 、锰、铜、锌（辅酶或激活剂） 、钴、钾、钠（调 节渗透压） 、氯。一般低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。 3.43.4 生长因子生长因子 生长因子是指氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等菌体必须地生理活性物质。在这种 天然培养集中已然含有无需添加。 3.53.5 水水 谁是生命活动不可或缺的物质，是细胞的主要成分，良好的介质，营养传递的道体， 调节细胞生长。 3.53.5 前体物前体物 在抗生素发酵过程中加入前提物可以控制菌体合成抗生素的方向和增加抗 生素的产量。在螺旋霉素发酵中不同的前体物对发酵有不同的影响。 本设计用正丙醇（3C）作为前体物，加量在 0.668%1.000%之间，分次加 入

24、，每隔十六小时加一次。 4 4 灭菌灭菌 灭菌是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中的一切有生命物质 的过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌法，电磁波射线灭菌法，干热灭菌法， 湿热灭菌法，过滤除菌法，火焰灭菌法。因本设计是针对大型工业发酵的设计， 因此一般采用蒸汽湿热灭菌法。 在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛采用湿热灭菌法。工厂 里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单又廉价有效的灭菌方 法。用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热温度和受热时间与灭菌程度和营养 成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以 灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作的主要矛

25、盾。 4.1 连续灭菌流程及设备连续灭菌流程及设备 培养基的分批灭菌就是将配置好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入 蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程。而规模较小发酵罐往往采 用分批灭菌的方法，又叫实罐灭菌。工业生产中大规模的灭菌应尽量采用高温 短时间的连续灭菌。连续灭菌具有以下特点： 与分批发酵相比培养液受热时间短，可缩短发酵周期，同时培养基成分 破坏较少。 产品质量交易控制。 蒸汽负荷均匀，锅炉利用率高，才做方便。 适宜采用自动控制。 降低劳动强度。 培养基经连续加热、维持和冷却后进入发酵罐。 4.1.14.1.1 流程的选择流程的选择 流程可分为：连消塔喷淋冷却流程、喷射加热

26、真空冷却流程、板式换 热器灭菌流程本设计采用连消塔喷淋冷却流程。 具体步骤：配好的培养基打入连消塔与蒸汽直接混合，达到灭菌温度后进 入维持罐，维持一定时间后经喷淋冷却器至一定温度后进入发酵罐。连续灭菌 的基本设备一般包括： 配料预热罐，将配好的料液预热到 6070 ，以避免灭菌时由于料液 与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声； 连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料 液的温度很快升高到灭菌温度； 维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的； 冷却管，从维持罐出来的料液要进行冷却管冷却，生产上一般采用冷却 水喷淋冷却，冷却到 4050 后，输送到预先已灭菌过的

27、罐中。 相较于其他两种连续灭菌流程来说连消塔-喷淋冷却流程灭菌较彻底，而喷 射加热-真空冷却流程中由于真空的影响，再蒸发室下要安装一台出料泵，或将 蒸发室置于离发酵罐液面 10m 以上的高度，否则物料就不能流进发酵罐而进入 真空系统，这就带来了不方便，尤其是对于已经灭菌好的培养基来说，出料的 泵的密封要求很高才能避免重新污染。故此不采用。 而板式换热器流程进行连续灭菌时加热和冷却 比喷射式连续灭菌长，灭菌 过程中的所需设备多，操作较为麻烦，染菌机会多。故此不采用。 4.24.2 连续灭菌的操作连续灭菌的操作 培养基在采用连续灭菌时，发酵罐应该在连续灭菌前先进行空罐灭菌，通 常先把发酵罐的空气过

28、滤器灭菌并用空气吹干。加热器、维持罐及冷却设备也 应先行灭菌。组成培养基的不同成分可以在不同的温度下分开进行灭菌，以减 少培养基受热破坏的程度。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到 131 ， 短时间保温 8min 后，被快速冷却，在进入早已灭菌完毕的发酵罐 （1）配料 配料罐用于培养基的配置。然后将培养基用泵打入预热桶中。 、 （1）预热 预热桶的作用一是定容，而是预热。预热的目的是使培养基在 后续的加热过程中能快速的升到指定的灭菌温度，同时避免太多的冷凝水带入 培养基，还可减少震动和噪声。一般可将培养基预热到 7090 . （3）预热好的培养基由连消泵打入加热器。加热器也称连消塔，使培养基

29、 与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度。加热采用的蒸汽压力一般为 0.450.8MPa， 其目的是使培养基在较短时间（2030s）里快速升温。加热器有塔式加热器和 喷射加热器两种。 （4）保温 保温是将培养基维持灭菌温度一段时间，使杀灭微生物的主要 过程。其设备有维持罐和管事罐两种。保温设备一般采用保温材料包裹，但不 直接通入蒸汽。 （5）降温 升降温快是连续灭菌的主要特征之一，为避免培养基营养成分 的破坏，保温后的培养基需要迅速降温至接近培养温度（4050 ）.国内大 多采数用喷淋冷却设备，也有采用螺旋板式换热器、板式换热器、真空冷却器 等。反应根据培养基的特点、处理量、场地特性选用喷淋冷却设备。

30、4.34.3 连续灭菌的计算连续灭菌的计算 连续灭菌包括升温、保温和降温三个阶段，灭菌主要是在保温过程中实现 的，在升温后期也有一定的灭菌作用。 此发酵罐内装培养基 835.713=278.57,在 131下进行连续灭菌，设每毫 升培养基中含耐热的芽孢为 107个，培养基体积流量 G10m3/h=0.17 m3/min 灭菌时间的计算 ：连续灭菌时间的确定应参考理论灭菌时间作适当延长或 缩短。发酵罐采用 300m3容积。在 131 下进行分批灭菌，此温度下的灭菌速 度常数为 0.25 s-1。 则培养基中活微生物： N0 =278.57106107=2.81015个 经过 时间灭菌后培养基中的

31、活微生物： Ns0.001 个 根据： Lgk=14845/T 36.127 =14845/(273+121)36.127 =1.55 得 k=0.0281s-1 理论灭菌时间 =1/kln （N0/ Ns） =1/0.0281ln（2.81015/0.001）=692.07s =11.5min 实际灭菌取理论灭菌时间的两倍 23min，约为 1h。 以下是关于灭菌保温时间的计算： C0=107个/ml CS=0.001/278/106/103=3.610-15 =ln（C0/CS）/k=81S 在维持罐内的物料会有反混，为保险起见，实际维持时间取理论灭菌时间 的 5 倍。 =815=405s

32、=6.75min 维持罐的体积的计算： 维持罐的体积 V=G实 培养基体积流量 G10m3/h=0.17 m3/min 则 V =0.17 m3/min6.75min=1147.5L 维持罐的 H/D 一般为 1.21.5，装料系数为 0.850.9（取装料系数为 0.85） 则维持罐的实际体积： V实=2m3 5 5 空气除菌空气除菌 空气是由氮气、氧气、二氧化碳、惰性气体、水蒸气以及悬浮在空气中的 尘埃等组成的混合物。空气除菌经常可以检测到一些细菌及其芽孢、酵母、真 菌和病毒。 无菌空气的制备：原理及简单过程：微生物体积很小，空气中附着在尘埃 上的微生物大小为 0.55m。过滤介质可以除去

33、游离的微生物和附着在其他 物质上的微生物。其原理在于空气通过过滤介质时，颗粒在离心场产生沉降， 同时惯性碰撞产生摩擦黏附，颗粒的布朗运动使微粒之间相互集聚成大颗粒， 颗粒接触介质表面，直接被截留。气流速度越大，惯性越大，截留效果越好。 惯性碰撞截留起主要作用，另外静电引力也有一定作用。 无菌空气的制备一般是把吸入的空气先经过压缩机前的过滤器过滤，再进 入空气压缩机，从空气压缩机出来的空气（一般压力在 1.96105Pa 以上，温 度 120150） ，先冷却到适当的温度（2025）除去油和水，再加热至 3035，最后通过总过滤器和分过滤器除菌，从而获得洁净度、压力、温度 和流量都符合要求的无菌

34、空气。具有一定压力的无菌空气可以克服在预处理、 过滤除菌及有关设备、管道、阀门汇总的压力损失，并在培养过程中能够使发 酵罐维持一定的罐压。 因此，过滤除菌的流程必须有供气设备空气压缩机，对空气提供足够 的能量，同时还要具有高效的过滤除菌设备以除去空气中的微生物颗粒。要保 持过滤器在比较高的效率下进行过滤，并维持一定的气流速度和不受油、水的 干扰，则要有一系列的加热、冷却及分离和除杂设备来保证。 5.15.1 空气预处理与设备空气预处理与设备 采风塔：在工厂的上风头，高度一般在 20m 左右，设计流速 8m/s。可建在 空压机的屋顶上。 粗过滤器：安装在空压机吸入口前，前置过滤器。作用是截留空气

35、中较大 的灰尘，保护压缩机，减轻总过滤器的负担，也能起到一定除菌作用。介质为 泡沫塑料（平板式）或无纺布（折叠式） ，流速 0.10.5 m/s。要求是阻力小， 容灰量大。 空气压缩机：作用是提供空气流动的动力。常用往复式、螺杆式、涡轮式 空压机。 空气贮罐：消除压缩空气的脉动，用于往复式空压机。螺杆和涡轮式提供 均匀连续空气可省去。设置在空压站附近。 冷却器：空气压缩机出口气温一般在 120，必需冷却。在潮湿季节，除 湿。空气冷却器的传热系数为 105W/(m2)。采用双程或四程结构，两级串联 使用。第一级循环水冷却，第二级低温水（9）冷却。设置在发酵车间外。压 缩空气每经过 1m 管道，温

36、度下降 0.51.0。 5.25.2 油水分离与设备油水分离与设备： 气液分离设备：除去空气中油和水，保护过滤介质。旋风分离器和丝网除 沫器两类。 旋风分离器：利用离心沉降原理。结构简单，阻力小，分离效率高。压缩 空气的速度 1525m/s，切线方向进入旋风分离器，在环隙内做圆周运动，水 滴或固体颗粒被甩向器壁，而收集。完全除去 20m 以上离子，对 10m 离子 的分离效率为 6070。 丝网除沫器：利用惯性拦截原理。对 1m 以上的雾滴除去率 98。 空气加热设备：空气相对湿度仍然为 100，需要降到 70以下，才能 进入空气过滤器。列管式换热器，空气走管程，蒸汽走壳程。套夹式加热器， 空

37、气走管程，蒸汽走夹套 空气过滤介质与设备：要求除菌效率高，耐受高温高压，不易被油水污染， 阻力小，成本低，易更换。常用的介质有棉花、活性炭、玻璃棉、超细比例纤 维纸、石棉滤板等。 纤维及颗粒介质过滤器：圆筒形，直径 2.53m。孔径 1015mm。空气从 下方进入，上方引出。常用介质棉花、玻璃纤维、活性炭等。空气流速 0.20.3m/s。可作为总过滤器。总过滤器每月灭菌一次。应该有备用过滤器， 灭菌时交换使用。 5.35.3 生产规模设置生产规模设置 二、三级过滤器，第一级为总过滤器，二、三级为分过滤器。 空气过滤除菌的工艺流程: (1)空气净化的一般流程如下：空气吸入口粗过滤器空气压缩机一

38、级空气冷却器二级空气冷却器分水器空气储罐旋风分离器丝网除沫 器空气加热器总空气过滤器分空气过滤器无菌空气。 (2)为了获得无菌空气，一般采用三个主要工段。第一个工段提高空气的 洁净度：前过滤器可减少压缩机活塞和气缸的磨损，减少介质负荷。第二个工 段除去空气中油和水：采用分级冷却，一级冷却采用 30左右的水使空气冷却 到 4050，二级冷却器采用 9冷水或 1518地下水，使空气冷却到 2025。冷却后，空气湿度提高了 100，湿度处于露点以下，油和水凝结 成油滴和水滴，在空气贮藏罐内沉降大液滴。旋风分离器分离 5m 以上的液滴。 丝网除沫器分离 5m 以下液滴。第三个工段获得无菌空气：分离油水后的空气 湿度仍然达 100，温度稍下降，就会产生水滴，使介质吸潮。加热提高