柑橘黄龙病的预警及防治技术

1、柑橘黄龙病的预警及防治技术摘 要2第一章 前 言31.2 国内外相关研究进展31.2.1 柑橘黄龙病病原研究31.2.2 柑橘黄龙病防治措施的研究进展41.2.3 黄龙病检测方法进展5第二章 黄龙病特性剖析72.1 黄龙病概况82.1.1 症状特点82.1.2 生物学特性82.2 病发媒介及条件92.2.1 虫媒简介92.2.2 柑橘木虱习性92.2.3 流行条件102.3 病情分级102.3.1 旧型分级标准102.3.2 新型分级标准11第三章 疫情检测及防护措施113.1 检疫方法113.1.1田间简易检测113.1.2生化指标检测113.1.3显微镜检测123.1.4 血清学检测123

2、.1.5 生物分子检测133.2 拟采用的防治措施153.2.1 化学防治153.2.2 茎尖微芽嫁接（STG）脱毒153.2.3 利用砧木的耐病性防治柑橘黄龙病163.2.4 从病源地和运输途径控制柑橘黄龙病163.2.5 热处理163.2.6 RGA 法克隆候选抗病基因17第四章 实案研究184.1 调查对象概况184.1.1往年柑橘黄龙病防控工作开展情况184.1.2 当前疫情发生情况及工作打算204.2 通道县柑橘黄龙病普查情况214.3 通道县柑橘木虱的发生及综合防治技术234.3.1 通道县柑橘木虱概况234.3.2 通道县柑橘木虱的发生和危害234.3.3 通道县柑橘木虱发生规律

3、234.3.4 柑橘木虱综合防治技术244.4 柑橘黄龙病发生危害与防治指标研究254.4.1柑橘黄龙病发生危害简介254.4.2 防治指标254.4.3 材料与方法254.4.4 结果与分析264.4.5 本章小结与讨论29第五章 展望34致 谢34参考文献35摘 要 橘黄龙病被称作柑橘病害中的不治之症，本文主要从柑橘黄龙病的危害情况以及产生的影响两个方面对其进行了详细的介绍，并对近年来的柑橘黄龙病综合防治的研究成果进行了总结，从物理防治层面和化学防治层面分别对柑橘黄龙病的防治技术的进展进行了详细的阐述，并以通道县的柑橘黄龙病防治工作作为实例进行分析，对其提出具有针对性的防治着重点，希望可以

4、为柑橘黄龙病的防治提供有力的理论依据。关键词：柑橘黄龙病；预警; 防治指标; 综合治理AbstractCitrus Huanglongbing has become the most serious threat for citrus farming.This paper make a detailed introduction to the two aspects of the damage of Citrus Huanglongbing and its impact.And the research results of the comprehensive prevention and c

5、ontrol of Citrus Huanglongbing in recent years are summarized.This paper is analyzed as an example of Citrus Huanglongbing prevention and control in Tongdao Town.At last,this paper puts forward the target of prevention and cure of Huanglongbing and hopes to provide a powerful theoretical basis for t

6、he prevention and treatment of citrus Huanglongbing.Key words: Hanglongbing;early warning;prevention index第一章 前 言1.1引言柑橘作为世界上交易量最大的商业类瓜果产品之一，它的种植范围出现在138个国家或地区，如巴西、美国、中国、墨西哥、西班牙等（祁春节，2009），根据王秋萍的大数据统计显示，在世界范围内柑桔的年总产量早在2013年度就实现了三千万吨的历史性突破。在中国柑橘种植模式是“垂直和水平四带基地”（邓秀欣2004），柑橘生产已对中国的农产品产量做出了巨大的贡献，而在生产工程中

7、不时有一些要素限制着柑橘产量和品格的改善，病虫害的影响是严重损害柑橘经济价值的主要原因。2008年四川广元大食蝇造成柑橘内部生长蛆虫，柑桔病虫害造成品质下降、商品滞销，黑点病与黑霉病等病害造成柑橘外观品质降低、丑化，致使产品价钱下跌（陈国庆，2014）。就目前对柑桔病害的了解情况来看，柑橘黄龙病是众多病害中造成疫情最为严重的一种。早期出现的，疑似是黄龙病的描述是在1700年的印度，当时这种病被人们命名为顶梢枯死病，国内最先发现这种病是在潮汕地区，20世纪中期被林孔湘验证这种病的传播方式包括嫁接。21 世纪初再次研究统计时发现，国内仅有的十九个具有生产柑橘能力的省市地域中，11个省市地域都出现了

8、黄龙病的身影，对国内柑橘产业的长期发展战略起到了很大的阻碍作用(黄丽，2013）。在2004 年时在巴西也发现黄龙病，2005年该病害成功入侵了美国的佛罗里达地区，之后黄龙病更是传染了整个佛罗里达和乔治亚州，令佛罗里达的柑橘产业经济损失高达70余亿美元（Elizabeth et al., 2014）。黄龙病在世界范围内传播的越来越广，对柑桔产业链造成了很大的损害，各区域的柑橘园受损程度不同，损失较小的产品数量减半，损失较大的破园停产。经过技术的改善和科技的发展，当下对黄龙病的研究在每个领域都取得了突破性的进展，如病原物基因组序列的测定、一系列早期检测手段的建立、分子手段对新药物的研发等，但是在

9、对柑桔黄龙病防控方面的研究成果依然很是匮乏，目前普遍采用的方法措施还是清理病株、预防柑桔木虱的发生以及培育无毒幼苗这三大类（周常勇，2014）。为了更好的做到对黄龙病的防护，我们的研究视线应该放在前期快速准确的检测手段和拥有实际防护成效的方法之上。 1.2 国内外相关研究进展1.2.1 柑橘黄龙病病原研究历年来，相关研究对柑橘黄龙病病原体的类支原体、类立克次体、类细菌的三个阶段进行了探索（Jagoueix et al.,1994）。现阶段通过对黄龙病的显微镜观察、单株数据分析、基因组测序等方法，初步定论黄龙病病原体外的这层膜是一种仅在柑橘韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌，到现在也未建立其相关的培养

10、体系(Doetal.,2005)。柑桔黄龙病主要靠虫媒来进行大范围的传播，其传播媒介为木虱（Diaphorina citri），以病原热敏感性的不同、传播的媒介以及病原菌在16S r DNA 区的差异为分类标准可以将木虱大致分为亚洲种、非洲种和美洲种三个品种。2009 年 Duan等同系列目的基因的测序工作成功得到了“Ca. L. asiaticus”的全基因组序列，该资料的获取为研究黄龙病的相关人员提供了可研究其多态性的基因位点，从此之后柑橘黄龙病病原分化研究进入了一个新的领域。1.2.2 柑橘黄龙病防治工作的历史进程1.2.2.1 黄龙病传统脱毒方法扩展研究黄龙病很早就被世人所知，对其进行

11、的研究也不在少数。在传统成熟的脱毒方法基础上，各地域秉着弘扬和改善的态度为其无毒幼苗的生产系统做出了进一步的努力和探索。 经过前人努力研究发现，如果能够在合适的条件下对植株进行高温处理，那么就可以有效的消除黄龙病所带来的毒性，在 48-51的湿热空气环境中对其处理 45-65 min 可以明显降低椪柑和焦柑病株体内黄龙病菌数量（林孔湘，1965）。此外，关磊的研究团队以树龄为八年的柑桔树为实验对象，对该树进行覆盖薄膜操作后又进行热处理，在和对照组即未覆盖薄膜的树本对比后发现：热处理方法稀释黄龙病浓度的效果比较显著（关磊等，2012）。Sharma 等人还将热处理方法和微芽嫁接技术混合施用，以环

12、斑病毒为实验对象得出结论：热处理方法是一种效果明显的脱毒手段（Sharmaetal., 2011）。 药剂筛选方面，有效药剂处理方面的报道鲜有出现，一般情况下，大多使用四环素等抗生素进行药物处理，然而，现阶段还未生产出针对黄龙病的特效药。柯冲将 500-l000 ppm 的四环素和青霉素混合在一起对病芽进行处理，效果显著，没有发病的案例出现（柯冲等，1979）。陈仕钦利将三种备选药剂分别利用韧皮部输液的方法注入植株之中，对实验材料的数据收集持续了八个月，进行对照实验后，结果发现1 g/L的2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺（DBNPA）、氨苄青霉素和异噻唑啉酮对黄龙病菌的的相对防效分别达到89.7

13、5%、87.27%、83.72%（陈仕钦，2013）。张木清的研究团队使用对比的研究方法，第一种配方是硫酸链霉素和青霉素混合使用；第二种配方是春日霉素和四环素混合使用，采用两种配方分别对患黄龙病的柑橘植株进行处理，结果表明两种配方皆可以降低黄龙病病原的浓度（Zhangetal.,2013），依照结果对实验用抗生素进行分级定义，可将抗生素分为三大类：强效型、中效型、弱效型（Zhanget al., 2014）；有资料表明植物抗病毒剂在其他作物上使用可以起到不错的效果，将这种方法转嫁到柑橘植株上，乔芬的研究团队使用这种方法，首先将板蓝根中药材与黄芩进行水浴加热处理，然后利用微芽嫁接技术将处理过的中

14、药材转嫁到染病植株上，最后的结果表明使用这种方法可以成功的使黄龙病的脱毒率达到80%以上（乔芬等，2011）。 在微芽嫁接这一技术领域，1975年的Navarro 的茎尖微芽嫁接方法是最先得到证明可以成功脱毒的鼻祖，延续到现在已经有了40余年的历史（Navarro et al.,1975; 1991）。科技力量较为雄厚的地域利用柑橘良种无毒幼苗的方法进行生产，借用这种方法希望可以增加单位面积产量，但是国内技术力量不足，无病毒苗木生产技术还处于开发阶段（周常勇等,2006）。失去微芽嫁接技术的柑橘无毒幼苗生产难以达到稳定的产业链，该技术的意义在于能够将无毒的组织结构完整分离出来。经各方专员努力探

15、究，事实已经证明茎尖微芽嫁接技术是短时间内能够满足无毒幼苗生产的最佳方法(宋瑞琳等，1990；姜玲，2007；廖祥六等，2007）。但是这种方法也有弊端，因为需要嫁接嫩芽的原因，这种方法受到季节的限制，而且苗木的成活率得不到保障，在进行实际应用时并不可靠。前任已经研究出了许多利用成熟组织培养获得嫩芽的办法，并且这种培养体系几近完善（洪磊等，2009)，然而还是没有突破季节的限制。1.2.2.2 拮抗黄龙病的相关化学药剂的研究 科技力量愈发的强大，分子生物化学技术也得到了长足的进展，目前还是主要使用人工或天然化学药剂的方法来进行柑橘黄龙病的防护与治疗。值得一提的是，王林婧等针对革兰氏阳性菌合成的

16、平板霉素能很好地与脂肪酸代谢中FabF 酶的 17 个残基结合从而抑制脂肪酸的合成（王林婧等，2011）。此外，类似于 Fab H、Fab B 酶的这样可以在生理生化过程起一定影响的药剂逐渐被开发出来（Young et al., 2006），对黄龙病菌的防治同样可以采取类似的原理来进行模拟试验，然而现实中受到研究经费的限制，借此研究有较大的困难。1.2.3 黄龙病检测方法进展 在田间进行对黄龙病判断主要查看叶片是否黄梢、斑驳型黄化、缺素状黄化症状，产看黄龙病成熟的果实等现象，例如果子泛青果以及红鼻子等症状，在这些症状中辨别度最高的是黄梢和斑驳的症状，在田间进行诊断时，以这两个症状作为柑橘的黄龙

17、病有力证据。但是这很容易被误诊，因为其他的病害又或者是橘园的营养不良也会造成这些症状的产生，因此在黄龙病的诊断上比较容易出现失误。由于以上原因，专业学者特意为此研究出一套辨别度较高的诊断方法，比如指示植物检测法（Schwarz, 1968），单克隆抗体检测技术（Garnieret al., 1982）以及免疫学检测（柯穗等，1989），但是这些方法在灵敏度、特异性又或者是应用上都或多或少地存在一些瑕疵，实用性并不是很强。 这些年来，科技力量的大幅增强，致使更多的分子生物学技术可以在黄龙病检测这一方面起到作用。聚合酶链式反应的技术优点在于高特异性、高灵敏性以及操作很是简便，这是现阶段在黄龙病检测

18、上最常规使用的方法。除了常规方法之外，当下使用较多的的柑橘黄龙病分子诊断手法还有常规 PCR、荧光定量 PCR 及巢式 PCR 技术。除了国外的研究之外，国内的相关研究院也设计了实用性很强的特异性引物（田亚南等，1996）。常规 PCR 技术的发展，可以更快、更准的检测出黄龙病病原，瓷技术特异性以及灵敏度都有良好的表现，可在黄龙病基础诊断上大肆推广（邓晓玲等，1999；董高峰等，2003）。以常规PCR技术为基础，针对性提高灵敏度和特异性的巢式PCR技术（Nested-PCR）表现更加优良，别名套式 PCR，实质就是使用两套 PCR 引物分别进行两次扩增反应。另外，有研究表明采用 Nested

19、-PCR 可以比常规 PCR方法更加快速的检测到感黄龙病植株中的病原，并且具有更高的灵敏度（丁芳等，2004）。但是，因为 Nested-PCR 灵敏度很高而且容易被污染的原因，假阳性现象在检测过程中出现的次数较多，客观性不足。由此可见，是用这个办法进行黄龙病原菌监测需小心实验操作。这些年来还开发了名为实时荧光定量 PCR（q PCR）的新兴技术，在准确定量黄龙病病原的检测研究上取得了较好的成绩，此手段检测黄龙病病原原的灵敏度要比常规 PCR 和 Nested-PCR方法效果更好，特异性和重复性也更加出色。和常规的PCR技术比较，q PCR 方法更加具备操作简化、不易污染、高灵敏度和高稳定性的

20、优势，在其他资料中验证了此效果的真实性（Wanget al等, 2006）。Kawabe 的研究团队（2006）使用荧光定量 PCR 对患有黄龙病植株的不同部位分别做了检测，目的是找出菌体附着浓度最高的部位，最终的研究成果显示感病植株的叶柄处和叶中脉的菌体浓度最高，树皮部位次之，而树根部位最少，最后得出病原菌在寄主体内呈不均匀分布的结论。刘晓露（2014）从田间感黄龙病砂糖橘植株上采集不同部位的叶片样品，利用基于 Taq Man 探针法的 q PCR 技术检测“Ca. L. asiaticus”浓度，研究结果显示，在确定患有黄龙病的病株枝条上，老叶所含的病原菌浓度最低，嫩叶所含的浓度相对较高，

21、而成熟的叶片所含的浓度最高，没有发病迹象的枝条上几乎检测不出来病原菌的存在。 1.3 选题的目的和意义 柑橘黄龙病（Candidatus liberobacter asiaticum）的发病迹象较为明显，各地果农根据发病特征也将黄龙病称为黄梢病或者是青果病。因为现阶段并没有针对此病的特效药剂，在植株感病后只能整株挖除，因此特称为柑橘的不治之症。得病的柑橘会出现叶片斑驳、叶片黄化、脱叶落果、发育减缓以及品质下降的现象，这对该产业链的经济效应造成了沉重的打击。目前，柑橘黄龙病流传较广，在世界范围内，亚洲等四个州以及 40多个国家和地区都发现了柑橘黄龙病的身影1。最初人们误以为柑橘黄龙病的出现是病毒

22、造成的，经过长久的科学试验发现柑橘黄龙病是由原核生物变形菌门亚纲韧皮部杆菌待定属(Liberobacter) 难纯培养细菌造成的2，其病原菌目前为止也没有办法可以得到纯培养，所以进一步的实验研究难以展开。现阶段对柑橘黄龙病的防护和控制还没有实质性的方法措施，只能依靠限制柑橘木虱、整株挖除病株和培育无毒幼苗三种主要办法来防控3，尽管效果不明显，但是相关人员依然在积极研究对柑橘黄龙病的防控措施。第二届国际柑橘黄龙病研讨会在两千零一年的时候在美国成功举办，虽然在该研讨会上并没有研究人员拿出具有抗病特性的柑橘幼苗，但是经过技术共享还是得出了一些成果，找到了不同品种对黄龙病抗病性与感病性的不同之处，所以

23、我们可以根据这一点来进行黄龙病的防治，在专业领域对于柑橘的分子抗性育种工作也正在不断的研发之中4。本人依据国内外现阶段的研究现状，对柑橘黄龙病的防治研究工作进行相关陈述。第二章 黄龙病特性剖析2.1 黄龙病概况 中国最早发现柑橘黄龙病的年份纪录是在1919年，最早的发生地是在广东5。30年以后，在广东等地的柑橘产区也有此病的出现；在1970年到1980年这个时间范围内,柑橘黄龙病又在国内其他产区有所发现，病害程度有所加强。黄龙病不仅仅发生在国内产区,在南亚、东南亚以及阿拉伯岛等地也均有发现6。2.1.1 症状特点黄龙病在早期的表现并不是很明显，常常只出现 12条黄梢，民间戏称为“鸡头黄”或“插

24、金花”，逐渐的黄梢越来越多，到了后期病株黄化枯死。黄梢上的叶片黄化不均匀，有时是整体的黄化，有时仅仅是黄绿相间的斑驳，直到秋季末期病叶会逐渐脱落。第二年春季，染病的植株相较正常植株发芽更早，而且新生出的梢比较短小、纤细，叶子变小且更具有硬度，叶片的主脉和侧脉皆呈现绿色，但是其它部位呈现出异常的黄色。染病植株的花期相对较早，并且开花很多，但是花朵不易成果，大部分会自动脱离母本。2.1.2 生物学特性 历史上曾经误以为柑橘黄龙病菌是类菌原体或类立克次氏体，后来经过与其它细菌结构的对比才发现，黄龙病的病原属于革兰氏阴性细菌中的其中一种。该细菌属于韧皮部杆菌属，有亚洲种 （Candidatus lib

25、erobacter asiaticum）、非洲种（Candi -datus liberobacter africanum）和美洲种（Candidatus Liberibacter americanum）3个种7。巴西的柑橘黄龙病有亚洲种和美洲种 2 种，美洲种占的比例较大，然而大多数是混合侵染8。柑橘黄龙病菌属于专性寄生菌中的一种，当下还没有研究出人工培养的办法。柑橘黄龙病病菌的主要传播方式有嫁接、幼苗和木虱虫媒，其中虫媒传播是最主要的传播方式。以热敏感性、虫媒的种类以及地区分布为标准，可以将柑橘黄龙病病原细菌分为两个株系。在亚洲发病的柑橘病株，经过统计发现在2732区间是该品种最易感病的温度

26、阈值，柑橘木虱（Diaphorina citri Kuwayama）是其传播病菌的媒介，病原为柑橘黄龙病原亚洲株系（Liberobacter asiaticum）；在非洲发病的柑橘病株，经过统计发现在2024区间是该品种最易感病的温度阈值，非洲木虱Trioza erytreae（Del G.）是其传播媒介，病原为柑橘黄龙病非洲株系（Liberobacter africanum）。2.2 病发媒介及条件2.2.1 虫媒简介 柑橘黄龙病主要依靠虫媒的方式进行大规模的病菌传播，而橘黄龙病的虫媒媒介是柑橘木虱。柑橘木虱属同翅目木虱科，主要对宽皮橘、甜橙、金橘、柠檬等芸香科植物造成危害,是对植株新梢造成

27、胁迫最大的害虫之一。此害虫主要分布在运、贵、川等南方地区。从2002年开设为柑桔黄龙病疫区，为了使柑桔黄龙病控制在疫区范围内，不向外扩散，保护好湘西、湘南等柑橘产区，守好湖南西南关卡具有重要战略意义。2.2.2 柑橘木虱习性1 传病性许长藩（1988）等报道，橘木虱传播疾病不需要结群，单体即可传播，研究显示柑橘苗的发病率高达 80%，携毒成虫完整的传毒过程最少需要5 h，13 龄幼虫不具备传病能力，45 龄害虫具有传病能力，高龄害虫可以将自身的病原传染给成虫，但是病原不能经过繁殖的途径传染给子代。2 耐寒力柑橘木虱的生态幅较广，可以在零下18的强低温中存活十数分钟， 在零下10的低温中可以存活

28、四个小时以上。周启明（1990）经过研究提出假设，越冬的柑橘木虱成虫具有短时间内强行提高自身抗寒性的能力，只有在外界温度低于某零界点时，该机能才能触发，所以他们得出定论，逐级降温以及持久低温可以影响到木虱越冬成虫的成功率。3 生活史陈循渊（1982）等人的研究表明，柑橘木虱在广东地区一年内可发生12代左右；而在华南地区柑橘木虱在一年内只发生7代左右，且在九里香上比在柑橘上多34代。一般初代发生于3月中旬至5月上旬这段时期，末代发生于10月上旬至12月上旬这段时期。4 寄主植物柑橘木虱的寄生部位大部分是柑橘、月橘或者是九里香等芸香科植物新发的枝芽。2.2.3 流行条件1 幼苗带病、田间病株以及虫

29、媒的种群数量是影响柑橘黄龙病发生的根本原因。 通常情况下，10%以上的幼苗带病率又或者是20以上的田间病株率的产区，在此前提下虫媒木虱的数量比较大，那么基本会发生严重的病害；但是如果虫媒木虱不存在，则病害不会广泛传播，证明与病株数量无关。2 黄龙病的发生流行与气象条件有重要关系。黄龙病病菌在3至35中皆可正常繁育。温度 2228、相对湿度 80%90%条件下，可提高病菌的生长和传播的能力。如果日均温度在23之上，则病情扩散严重；如果日均温度在25之上且相对温度达80%之上，则黄龙病的发生和流行将会最大限度增强。3 田间管理和植株保护是预防黄龙病的有效措施如果能够长期保持挖除病树，并且严格遵守检

30、疫法规和苗木、接穗等繁殖材料的检疫管理，将对虫媒木虱的害情监测与防治做到位，严格按照指导技术进行栽培，并严格把控产区的肥料使用情况以及病虫防治等过程，产区病情发作就会减少减慢。如果是开放式管理，病情无疑会不可控制。4 良好的生态条件有利阻止病害蔓延。在海拔较高的产区，由于温度低下的原因，黄龙病发病率较低，病情传播也比较慢；又由于日照短，湿度大的原因，致使该产区拥有较好的防护林，这样就可以减缓木虱的生长、繁殖和传播速度，病情得到了抑制，流行速度也较为迟缓。5 不同种类和品种的柑橘树抗病或耐病性有差异。研究统计发现，蕉柑、大红柑以及福橘等品种比较容易的得病，而且传播速度很快，最终导致大面积的植株死

31、亡；温州蜜柑和甜橙则具有较高的耐病性；官溪蜜柚和金柑对黄龙病抗性较好。枳在种植时并没有明显的症状表现，但是换做砧木品种时，并不能增加接穗品种的耐病性。除此之外的红柑橘和酸橘等比较容易感染黄龙病的砧木品种，由于自身感病性过强的原因，因此对增强抗病性并没有显著的效果。2.3 病情分级2.3.1 旧型分级标准据文献记载旧型分级标准将病情分为6级。0级：全树无病；第1等级：感病植株上存在一两个带有斑驳黄化叶的梢；第2等级：一些枝干出现斑驳黄化的现象，感病枝干所占比例为全株的13及以下；第3等级：感病枝干所占比例为全株的13至23范围；第4等级：感病植株所占比例为全株的23以上；第5等级：整个植株完全死

32、亡。2.3.2 新型分级标准新型分级标准将病情分为4级。0级：全树无病；第1等级(轻度)：部分枝干存在斑驳黄化的现象，感病枝干所占比例为全株的13以下；第2等级(中度)：感病枝干所占比例为全株的13至23；第3等级(重度)：感病枝干所占比例为全株的23以上至整株完全死亡。理论上应该在虫媒控制较好的地方采取多种方法混合对柑橘黄龙病进行防控处理。第2、3等级病树全株挖除，第l等级修剪病枝、加强管理。通过这样的方法可以有效地防止柑橘黄龙病的发生，此外还可以同时增强柑橘的品质和产量，减少产区的经济损失。第三章 疫情检测及防护措施3.1 检疫方法3.1.1田间简易检测柑橘黄龙病外在表现最明显的特征就是叶

33、片斑驳黄化，其发生时期不受限制，对柑橘的品种也没有特殊的针对性，任何品种任何发育时期的任何部位都有发病的可能，现阶段对柑橘黄龙病的诊断以叶片斑驳为主。田间检测方法，把成熟期的新梢作为主要的观察对象，最佳观察时期是在每年的10到12月秋梢成熟之后，在这期间黄龙病的发病迹象最容易被肉眼分辨出来，以春梢叶片的斑驳情况来判定产区的黄龙病病树的成功率很高。而然随着病情的发展，黄龙病的症状也会随着环境的变化而产生变化，进一步发展的病情症状容易与其它病虫害的症状相混合，感病植株如果没有典型的感病特征则很难以被分辩出，这就又增加了对病情诊断的难度。所以，多种方法相结合的诊断手段更有利于病树的鉴别。初步的诊断是

34、观察植物外观而判定，将枝条嫁接到目标苗木枝干上，每次嫁接20株,3-4个月表现症状。张天淼的研究实验表明，桠柑最为适合当做柑橘黄龙病的指示植物，蕉柑的症状表现次之，欧柑的表现最差。3.1.2生化指标检测经相关研究，柑橘黄龙病现阶段无法实现人工分离培养，但受经济效益的影响，黄龙病的诊断需要快速且准确的方法，因而相关研究转向感染植株的生理变化层面，继而以感病植株的生化指标为标准。利用能从感病植株树皮或病果白皮层中提取正常植株没有的荧光物质一龙胆葡糖苷(gentisoyl-glucoside)，经nbutanol：aceticaeid：water(5：1：1)纸层析或薄层层析法进行鉴别,IJHLB和

35、裂皮病，对于HLB在365nm波长下可以观察到亮蓝紫色斑点，在发病初期有效。然而这种办法的缺点在于特异性不足，加州某一橘的受损组织中也发现了这种生化物质的存在。1975年国内首次使用荧光显微镜检测的办法，发现在感病植株的韧皮部中发现到了黄色荧光的存在，这种荧光在健康的植株又或者是其它受伤部位并没有出现过，除此之外研究人员还发现使用蕃红染料对患病柑橘进行染色能够令其韧皮部呈现红色。3.1.3显微镜检测在显微镜的镜头下，无论是菌体的形态、大小又或者是菌的壁膜结构都可以清晰的表现出来，可以通过这些外在表现来进行黄龙病的辨别9。但是这种观察法也存在缺点，因为黄龙病病原在树体上存在的菌量很少而且呈不均匀

36、分布状态，这些因素导致电镜成功率只有6070，实用性不强。随后有关研究人员使用投射式荧光显微镜来对黄龙病的病原进行观察研究，但是此方法依然有缺憾，缺点在于观察的材料必须是完全成熟的叶片才行。而且在同一个病株上，利用这种方法可以在秋梢叶上检查出病原，但是并不能用于在春梢叶片和花柄上的检查10。而使用FBA染色法的注意事项在于要以各梢期的新梢主叶或嫩茎为实验对象，样品切片厚度以3040pm最佳11。显微镜观察法优点在于简单、直观，但是试验过程中所受限制过多，失误率较高，实用性不强。3.1.4 血清学检测80年代有关研究表明使用兔丝子做材料能够使病原体完成从柑橘到长春花上的转移，从而使病原体得到更佳

37、的环境进行繁育，所以病原体的浓度很高，更有利于获取菌体较为完整的粗提纯物12。1987年原核生物抗血清和单克隆抗体成功问世，但是实验结果发现血清不具备很好的特异性，其与黄龙病病原反应之外，还具有其它可以与之产生原核生物反应的物质存在13。随着科技的发展，黄龙病病原的单克隆抗体也逐渐问世，但是这样的单克隆抗体依然有其短板，单克隆抗体的特性只允许其和相似的抗原产生反应，甚至有时只与特定的抗原发生结合反应，这样容易出现假阴性的现象。国内李德望14等研究人员先后使用血清学方法对国内的柑橘黄龙病进行试验检测，依然没能令检测范围过小等实际困难得到完美的解决。3.1.5 生物分子检测（1）分子杂交分子杂交技

38、术原理：待测核酸及标记探针充分利用核酸单链间核苷酸键之间的同源亲和性，由此来展开分子之间的杂交，通常情况下，在杂交过程中，两条单链形成双链主要是利用碱基互补原则。其中，放射性同位素通常作为标记物，除此之外，还可能会利用非放射性物质，例如生物素等等。在完成整个杂交过程以后，可以利用标记探针放射自显影来进行检测。根据不同的应用范围，主要将核酸分子杂交分为两类：膜上印迹杂交以及原位杂交。具体来看，膜上印迹杂交主要是指细胞中的核酸进行分化并由此在相关支持物上面进行结合，在体外，核酸和液相中标记的核酸探针进行杂交。而膜上印迹杂交具体又能够分成两类，又可分为两种，主要是斑点或狭线杂交以及Southern杂

39、交或Northern杂交。Southern杂交或Northern杂交则主要是需要首先把大分子DNA或RNA进行变性处理，然后再借助琼脂糖电泳的方式把核酸进行转印，让它转移到膜上，如此就能够完成这种杂交反应。就原位杂交而言，这种杂交方式主要是指标记探针以及核酸进行杂交，其中，核酸指细胞或组织切片中的核酸，在完成杂交以后还需要进行检测。目前，该方法在病原检测中运用广泛，一个原因是这种检测方法具有特异性，另一个原因是这种方法可以对目标结构的DNA或RNA进行精确的定位。（2）PCR反应PCR又被叫做无细胞分子克隆，其主要是通过体外酶促扩增特异。通常情况下，我们所说的PCR反应过程包括三个步骤，得到新

40、合成的DNA链，其主要可以作为以后DNA合成的新的模板，整个过程需要进行30.35次的重复，只有这样，才能达到剐示DNA片段拷贝数呈指数级增长的目的。具体来看，PCR技术的特点多样，主要具体表现为：具有比较强的特异性。主要是将核酸作为靶标，由此来进行一定的选择性扩增；模板用量少，并具有非常高的检测灵敏度。可是如此之高的灵敏度也会在污染环境中引起假阳性，因此，在操作过程中必须要严谨细心；操作反应快速，不会出现放射性标记。通常情况下，三小时的时间范围内可以完成30次以上的循环扩增；没有很高的样品要求。好处在于只要样品中含有靶序列核酸就可以自动开始扩增。随着现代科技的发展，PCR技术的整体水平也在不

41、断的提高，其建立和发展促进了分子生物学的变革发展，具有充足的活力，已经扩展到分子生物学的各个领域。广泛地运用于病原物检测，还实现了基因序列多态性的检测，并越来越多的应用到了疾病的早期诊断。黄龙病的PCR检测已经广泛的运用到了国际上的诸多实验室。就目前而言，柑橘黄龙病可以说是已经广泛的采用了PCR检测方法进行检测，而PCR检测方法又具体分为了三类，主要包括常规PCR、定量PcR以及巢式PCR。在1996年，法国Jagoueix运用了常规PCR扩增柑橘黄龙病，实现了1160bp的特异性片段长度。法国的Hocquellet等人在1999年则进行了引物的设计，主要是具体根据柑橘黄龙病的亚洲种以及非洲种

42、的核蛋白而言的。这种引物意义价值重大，具体可以扩增柑橘黄龙病的亚洲种以及非洲种，其中，扩增以后的亚洲种的PCR产物长度具体能够达到700bp，相应的，非洲种则主要可以扩增到650bp的PCR产物长度。区别柑橘黄龙病的方法主要是PCR产物长度的不同。在PCR定性技术的基础上，又进行了一系列的发展创新，创造出了定量PCR技术。PCR定性技术作为一种基因定量技术，解决了很多问题，实现了很大的发展，能够针对于模板浓度及检钡I基因变异动态进行准确的测定。在此之后，很多科学工作者对该技术进行了研究运用，在1996年，田亚南等人设计出了引物，并运用定量PCR技术进行检测，主要是针对于柑橘黄龙病进行检测，检测

43、对象是中国以及泰国的柑橘黄龙病。根据检测结果可知，虫媒柑橘木虱体内含有比较多的病原，除此之外还有长春花体内病原含量多，柑橘中则含有比较少的病原含量。在2000年，Harakava等人也针对于此进行了研究，研究具有一定的开创性，具体针对于柑橘黄龙病巢式PCR检测方法进行实验研究，实验结果表明，巢式PCR检验和常规PCR相比较而言具有更高的灵敏度。在2002年，还有更多的科研工作者进行了研究，例如李韬、柯冲，他们针对于此也做出了一定的研究，主要针对于柑橘木虱及九里香上黄龙病带菌率，并运用巢式PCR检测方法进行检测，根据研究结果显示，巢式PCRI比常规PCR具有更高的灵敏度。3.2 拟采用的防治措施

44、3.2.1 化学防治关于黄龙病的化学防治方法，现阶段的研究水平并没有研制出作用性较强的化学试剂。1970年至1980年，国内外的研究人员陆续尝试性的使用抗生素来做实验，试图找到抑制柑橘黄龙病的方法，经过一系列的研究发现，抗生素能够在一定程度上对柑橘黄龙病的发生起到抑制作用，但是作用很有限。国内的广西柑橘黄龙病研究团队经过多次实验成功的验证出四环素对抑制柑橘黄龙病的发展有一定的效果，证明了四环素可以抑制柑橘黄龙病的发生，并且经过对照实验发现，采用树干打洞灌注法能使抗生素发挥出最大作用20。此外,赵学源的研究实验表明，病株接穗再经四环素处理后，被嫁接的植株不会感染黄龙病，用青霉素处理后的植株的发病

45、率也有所降低21。罗志达等研究人员发现，使用加热后的四环素对病树的芽条进行再处理，相比于常温的四环素又或者是单纯的热水处理，这样的方法可以达到更好的治愈目的22。抗生素的方法虽有奇效，但是治标不治本，仅仅是暂时压制了黄龙病的发展，最晚三年后病情会复发，因此在使用抗生素对柑橘黄龙病进行治疗的方法上仍然需要科研人员投入更多的努力。3.2.2 茎尖微芽嫁接（STG）脱毒保证幼苗百分百无毒，才是最佳防治黄龙病的办法。柑橘茎尖微芽嫁接法（STG）经过实际检测证明其具有很强的实用性，柑橘茎尖微芽嫁接法实质是将柑橘幼苗的茎尖分生组织嫁接在试管中，然后经脱毒培养的砧木上获取整棵植株。自从该技术问世以来，至今已

46、经是柑橘产区使用次数最多的方法，同时STG技术也是培养柑橘无毒幼苗的核心方法，在育种繁育中也起到了很重要的作用23。此外，STG法也妥善解决了柑橘茎尖培养不易生根的困难，大幅度缩小了柑橘无毒幼苗童期，并且经此办法得到的幼苗没有产生恶性变异的情况，实用性很强。Navarro在西班牙使用这个方法成功培育出不具备毒性的柑橘母本，并以此为前提进行广泛的推广运用，实现了柑橘全面工业化生产，而且此类柑橘的产量和质量都得到了实质性的提升24。1980年，国内的研究员着手柑橘茎尖嫁接技术的探究，蒋元晖等人更是成功利用这个办法得到了没有柑橘黄龙病的植株25;陈駉从脱除病原这一方面进行研究，经过试验也成功得到了无

47、病柑橘植株26。随后的姜玲等人在前人基础上调整和改善，成功增加了植株的成活率27。3.2.3 利用砧木的耐病性防治柑橘黄龙病嫁接是柑橘进行繁殖进行的主要方法，而砧木作为树本的根基，它对柑橘的病状研究以及育种研究起到很重要的作用28。通过Albrecht等人的相关研究发现，砧木的品种并不会对柑橘黄龙病的发生造成影响，但是会影响到柑橘黄龙病的发病程度29。在1960年，国内研究人员尝试使用九里香来当做柑橘砧木，试图对柑橘黄龙病进行防治，但是实验并不成功，主因是亲缘关系过远，柑橘树的成活率不足以达到预期目标30; 随后Shinozaki 等研究人员依然想从九里香下手，它们采用细胞融合的方法，获取了两

48、者的体细胞从而取得杂种体细胞，这样的杂种细胞确实拥有耐黄龙病的生物特性，但是又因其生长周期过长且育出的小苗多畸形，这种方法以失败结尾31。九里香的优点在于其具有抵抗柑橘黄龙病的生物特性，而九里香的缺点在于其生理生化结构和遗传特性与柑橘大不相同，所以使用九里香作为砧木的可能性和实用性还有待进一步的考证。国外对培育出对柑橘黄龙病具有耐性的砧木品种这一方面一直很是关注，而且已经取得了一些进展，培育出来的杂交品种通过实际验证确实对柑橘黄龙病具有一定的抗病性26.33。3.2.4 从病源地和运输途径控制柑橘黄龙病经过实践检验后发现对黄龙病防治的最有效的方法是去根挖除和清剪病枝。从根源上减少了黄龙病发病的

49、可能，同时也限制了虫媒木虱的繁育，从这点而言，在进行新产区的开辟时一定要注意不能流入带病植株。在运输途径这一方面，最容易出现情况的就是异地引种的问题，只有持有合法的植物检疫部门的证书，反复确认苗种确实没有黄龙病时才能放行。此外，幼苗的生产和销售也要完全符合制度规定，一切违规的幼苗一经发现，必须烧毁处理。3.2.5 热处理经过前人的研究发现，柑橘黄龙病的病原细菌对热度很是敏感，在1960 年，林孔湘的研究团队在热处理这一方面进行了相关研究，研究结果显示，在4851的高温环境下对柑橘的枝条或幼苗进行45至60min的处理，可以有效灭杀柑橘黄龙病的病原，并且可以在一定程度上促进柑橘组织的生长发育34

50、。后来随后，国内的福建农科院采用覆盖薄膜法对染有柑橘黄龙病的病树进行热处理，实验结果显示，热处理对染有黄龙病的病树也同样有着作用效果，对减缓病情和抑制病害的扩散有一定的积极作用。热处理法虽有奇效但也有缺点，考虑到成本，这种方法并不具备实用性，而且热处理对幼苗有消极作用，幼苗成活率并不高，很难以实现工业化生产35-38。总的来讲，近阶段经过国内相关人员的努力研究，在对柑橘黄龙病防治这一领域上已经取得了突破性的进展39，总结为以下几点：一是从根源上杜绝发病的可能性，挑选无病区域进行大规模繁育种植。二是合理使用脱菌苗，以健康幼苗为基础进行后代的繁育。三是对发病植株完全挖根处理，不能因经济损失而心存侥

51、幸。四是在容易发病的季节预先使用化学药剂对嫩芽施用进行防治，在各个抽梢期进行最少两次、最多三次喷药处理。五是增大有机肥料的投入量，并进行合理的搭配。此外，黄龙病的防治也离不开相关政府部门和农业部门的协助，加大宣传力度，增加果农预防黄龙病热情，积极参与防治内容，政府理应为果农实施惠农政策，鼓励农户购买无病幼苗，减轻农户的经济压力，从根源上防止柑橘黄龙病发生的可能性。第四章 实案研究4.1 调查对象概况 2002年通道县进行柑橘黄龙病调查工作时，调查的范围主要是东江、孟龙、老寨、新江、三盘、城旋6这个村庄，数据统计显示这6个村皆有柑橘黄龙病疫情的发生。6个行政村共有28个村民小组、740户、317

52、0人。有柑桔面积1742亩，其中夏橙873亩、椪柑764亩、蜜桔105亩，户平有柑桔面积2.3亩，柑桔生产收入已经成为当地农民的主要经济来源。柑桔黄龙病发生面积373.5亩，柑橘黄龙病的出现不仅给果农带来严重的经济损失，甚至对产区范围内的城镇的经济产能都造成了一定的影响。最近几年，国内对绿色环保等方面愈发的重视，追求的本质是实现可持续发展战略，加深了对预防工作的认识程度，对防控工作有了较大的人力和物力的投入，并且获取了不错的实际效果，牢牢的把柑橘黄龙病的发病范围限制在了原发区域，有效阻止了病情的进一步扩散和蔓延，完成了保护未发病区的战略目标，消除了潜在的经济隐患。4.1.1往年柑橘黄龙病防控工

53、作开展情况（一）加强组织领导，落实保障措施1、加强组织领导在通道县重大植物有害生物疫情控防领导小组统一领导和指挥下开展防控工作，进一步加强柑桔黄龙病防控工作的组织领导。实行行政领导负责制和技术工作负责制，层层建立岗位责任制，使领导工作、部门工作相结合。县、乡、村工作层层分解，落实到组、农户桔园，全方位的监督管理坚决令黄龙病的防护措施落到实处。由坪阳乡柑桔黄龙病监测控防工作实施小组具体负责组织防控工作的实施。2、做好技术保障。由专业技术人员组成技术顾问，负责解决柑橘黄龙病的相关技术问题。办公室负责各股站的工作统一协调，植保植检站抓防控技术措施落实，经作站负责改种的技术指导，执法大队负责防控农资的

54、监督检查，各乡镇农技站参与实施。3、积极筹措资金。柑桔黄龙病重大疫情监测控防是一项系统工程，需要一定的资金保障。县农业局积极向县委、县政府领导做好工作汇报，得到县领导的高度重视，并得到县财政50万元的防控资金支持，疫情阻截、公共场所的无害化处理和疫情控防所需经费得到了落实，确保了通道县柑桔黄龙病控防工作的顺利开展。（二）制定了柑桔黄龙病控防工作实施方案根据省植保植检站柑桔黄龙病重大疫情监测控防工作部署，通道县属全省柑桔黄龙病重点控防区域县。增强对柑橘黄龙病的预防措施和检测强度，掌握控制病情的主动权，保证柑橘产业的良好运行，依据实际情况制定出符合实情的柑橘黄龙病的预防方案，核实柑橘黄龙病预防工作

55、的核心思想，确定工作内容和预期目标，从实际上行动，完成预防任务。（三）实事求是，着手开始柑橘黄龙病的预防和防控工作1、加强植物检疫工作，抓好疫区病源封锁不允许任何组织或者个人采购或者培育携菌柑橘幼苗，流入产区的柑橘幼苗和用于育种的繁殖材料必须经过一系列的检疫流程方可入园。2、抓好柑桔黄龙病的监测预警从每年4月上旬开始，分别在坪阳乡东江村、新江村和甘溪乡甘溪村、陇城镇路塘村设立了4个疫情监测点。每个监测点都需要派遣专人值守，以15天为一个周期，每一个周期都需要做一次田间调查，用以监测疫情发生动态。根据4个监测点的监测调查，除东江片外未发现新的柑桔黄龙病疫情。3、认真开展疫情普查工作2012年4月

56、20日农业局组织召开了全县乡镇农技员会议，集中进行了技术培训，统一安排了柑桔黄龙病的普查工作。对全县21个乡镇开展了普查工作，重点是和坪阳乡接壤的甘溪、陇城两个乡镇。全县共计普查面积22085亩，除坪阳东江片外，其他乡镇均未发现有柑桔黄龙病疫情发生。4、认真开展宣传和培训工作，提高群众控防水平柑桔黄龙病在通道县的坪阳乡已发生危害多年，但是很多柑桔种植户还是不了解。为此，采取培训、张贴标语、印发技术资料等多种形式开展宣传工作，使广大桔农认识到柑桔黄龙病发生和危害的严重性以及控防工作的紧迫性和重要性。在坪阳东江开展培训5期，培训人数1000人次，悬挂横幅6条，张贴宣传标语40条，印发技术资料200

57、0余份。5、积极做好柑桔黄龙病的控害防治工作。（1）开展柑桔木虱防治，消灭传毒媒介。每年组织农户开展柑橘木虱防治活动多达十次。其中春防2次，夏防3次，秋防3次，冬防2次。免费提供吡虫啉、啶虫脒、阿维菌素等价值13万多元的对口农药防治柑桔木虱13500亩次。（2）砍伐病树。组织桔农及时进行清园，砍伐烧毁柑桔黄龙病病树，并对病树蔸进行药剂处理，砍伐病树每株给予20元补贴，补贴直接打入农户的“良种补贴一卡通”存折中。累计砍伐病树5000余株，共计发放补贴10余万元到桔农手中。（3）抓好柑桔黄龙病检疫堵截。一是设点堵截。在马龙边境检疫监督检查站设立柑桔黄龙病检疫堵截点，凡从疫区运出的果苗都必须进行检疫

58、检查，发现问题及时进行查封，防止疫情扩散。通过检查未发现带有检疫对象柑桔黄龙病。二是对2010年4月份未经检疫从广西融安县调入的金桔苗木14360株继续进行疫情监测。其中溪口镇坪头村8500株，北麻村400株，马龙乡瑶团村3500株，下乡乡城坪村1000株，双江镇芋头村860株，播阳镇上寨村100株。（四）存在的不足通道县柑桔黄龙病经过认真控防，取得了一定的成效，但也存在一些问题。1、 检疫意识不强。部分群众对植物检疫法律法的认识不到位，不了解植物检疫的价值和重要程度，未经检疫随意调运幼苗和成品柑橘的现象常有发生。2、 控防工作不到位。部分群众对柑桔黄龙病控防工作意识不强，特别是近几年受柑桔价格