第二章可见-紫外分光光度法

1、.,仪器分析,主讲教师：高金波,Instrumental Analysis,.,第二章 光谱分析法概论,主讲教师 高金波,.,本章主要介绍:,光学分析法定义 光学分析的三个主要过程 电磁辐射和电磁波谱 电磁辐射与物质的相互作用 光学分析法的分类,.,基于物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用后产生的辐射信号或发生的信号变化来测定物质的性质、含量和结构的一类仪器分析法。,一、定义（光学分析法）,.,1. 能源（光源）提供能量 2. 能量与物质相互作用 3. 产生被检测的信号,二、光学分析的三个主要过程,.,1. 电磁辐射电磁波（光是其中的一部分） 它是一种以极高的速度传播的光子流 在传播过程

2、中不需要任何的物质作为传播媒介 它具有波动性和粒子性。,三、电磁辐射和电磁波谱,.,(1) 波动性表现在: 每种电磁辐射都有确定不变的频率,(2) 粒子性表现在: 每个粒子都具有能量 E,.,2. 电磁波谱: 电磁辐射按波长顺序排列而成,射线 x 射线紫外光可见光红外光微波无线电波,高能辐射区 射线 能量最高，可以引起核能级跃迁 射线 可以引起内层电子能级的跃迁 光学光谱区 紫外光 可以引起原子和分子外层 可见光 电子能级的跃迁 红外光 可以引起分子振动和转动能级的跃迁 波谱区 微波 分子转动能级及电子自旋能级跃迁 无线电波 以引起原子核自旋能级的跃迁,五、光学分析法分类,.,四、电磁辐射与物

3、质的相互作用,五、光学分析法分类,.,光学分析法,光谱分析法,非光谱分析法,.,.,第十章 可见-紫外吸收光度法,可见光区和紫外光区的划分: 200400nm为紫外光区 400760nm为可见光区 可见紫外分光光度法的定义 根据物质的分子对200760nm这一光区电磁辐射的吸收特性进行的物质成分分析与分子结构分析的方法,.,第一节 紫外-可见分光光度法 的基本原理和概念,转动能级差,0.0050.05V,振动能级差,0.051eV,外层价电子能级差,120eV,电子光谱,25025m,250001250nm,125060nm,吸收光谱,分子光谱,.,一、电子跃迁类型,预备知识：,价电子：电子

4、饱和的化合物或基团 电子 不饱和的化合物或基团 n电子 含有杂质原子的基团,轨道：电子围绕原子或分子运动的几率 轨道不同，电子所具有能量不同,.,图示,b,成键轨道与反键轨道：,.,一、电子跃迁类型：,1.*跃迁： 饱和烃（甲烷，乙烷） E 很高，150nm （远紫外区） 2. *跃迁： 不饱和基团（ C C ，C O ） E 较小，200nm 体系共轭， E 更小，更大,.,一、电子跃迁类型：,3. n *跃迁： 含杂原子不饱和基团（C N C O ） E 最小， 200400nm（近紫外区） 4. n *跃迁： 含杂原子饱和基团（OH， NH2 ，X，S） E 较大， 150250nm,按

5、能量大小： *n * *n *,.,续前,结论： 紫外光谱电子跃迁类型： n *跃迁 *跃迁 饱和化合物无紫外吸收 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系 根据分子结构推测可能产生的电子跃迁类型； 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型 推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）,.,二、紫外-可见法相关的基本概念,1 吸收光谱（吸收曲线）： 不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同 以波长吸光度A作图，所描绘的曲线为 2 吸收光谱特征：定性依据 吸收峰最大 吸收谷最小 肩峰 sh 末端吸收靠近200nm的呈现,.,图示,.,3 生色团（发色团）：,能吸收紫外-可见光的基团 有机化合物：具有不饱和键和

6、未成对电子的基团 具 n 电子和电子的基团 产生 n *跃迁和* 跃迁 E 较低 例： CC ； CO ； CN ；NN ， NO2等,.,续前,本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收 峰加强，同时使吸收峰长移的基团 有机物：连有杂原子的饱和基团 例：OH，OR，NH2，SR， X,4 助色团,.,续前,5 红移和蓝移： 由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后 吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移） 吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）,.,续前,6 增色效应和减色效应 结构发生变化时 增色效应：吸收强度增强的效应 减色效应：吸收强度减小的效应 7 强带和弱带：

7、 104 强带 102 弱带,.,三、吸收带类型和分子结构的关系,1 R 带：由含杂原子的不饱和基团的 n *跃迁产生 CO ； CN ；NN ， NO, NO2 特点：E 小， max250400nm，最大100 溶剂极性，最大蓝移（短移）,吸收峰的位置,.,三、吸收带类型和分子结构的关系,2 K 带：由共轭双键的*跃迁产生 特点：最大 200nm，最大104 ( CH CH )n ， CH C CO 共轭体系增长，最大红移，最大 溶剂极性，最大红移,.,续前,3 B 带：由*跃迁产生 芳香族化合物的主要特征吸收带 最大 =254nm，宽带，具有精细结构； 最大=200 极性溶剂中，或苯环连

8、有取代基，其精细结构消失,三、吸收带类型和分子结构的关系,精细结构,.,图示,.,续前,4 E 带：由苯环的环形共轭系统中的*跃迁产生的 芳香族化合物的特征吸收带 见图 E1 180nm最大104 （常观察不到） E2 200nm最大= 7000 强吸收 苯环有发色团取代且与苯环共轭时， E2 带与 K 带合并一起红移（长移）。,三、吸收带类型和分子结构的关系,.,图示,.,图示,.,*下列化合物 K 带的吸收波长最大的是： A： H2C=CH-CH= CH2 ； B：H2C=CH2； C：H2C=CH-CH=CH-CH=CH2； D ： H2C=CH-C=O,R 带是由_跃迁引起，其特征是波

9、长_。 K 带是由_跃迁引起，其特征是波长_。,*丙酮能吸收 280nm， 187nm和 154nm的紫外光，其中最长波长的吸收所对应的电子跃迁类型为_，该吸收带为_ 带。,*符合比耳定律的有色溶液稀释时，其吸收曲线的最大吸收峰 A上移； B 下移；C 左移；D 右移 *在分光光度法中，吸收曲线指的是： A. A一c 曲线； B. A一曲线；C. T一c曲线； D. A一T 曲线,练习：,.,续前,1 溶剂效应： 对最大影响： n-*跃迁：溶剂极性，最大蓝移 -*跃迁：溶剂极性，最大红移 见图解 对吸收光谱精细结构影响 溶剂极性，苯环精细结构消失 溶剂的选择极性；纯度高；截止波长最大 2 pH

10、 值的影响：影响物质存在型体，影响吸收波长,四、影响吸收带位置的因素：,.,图示,跃迁类型正己烷 氯仿甲醇 水 * 230 238237 243 n*329 315309 305,.,五、郎伯比尔定律,假设一束平行单色光通过一个吸光物体,（一）lambert-beer,.,1Lamber-beer定律的适用条件（前提） 入射光为单色光 溶液是稀溶液 2该定律适用于固体、液体和气体样品 3在同一波长下，各组分吸光度具有加和性,应用：多组分测定,讨论：,.,讨论:,4. C与A 的关系 (成正比关系) C=C0，A=A0 ； C=2C0，A=2A0； C=1/2 C0 ，A=1/2 A0 ； 5.

11、 C与T的关系 (指数关系) C=C0 ， T= T0 ； C=2C0，T= T02 ； C=1/2 C0，T=T01/2= ；,.,(二) 吸光系数*,1.物理意义： 一定，单位浓度、单位厚度的吸光度,讨论： 1）E=f（组分性质，温度，溶剂，） 当组分性质,温度和溶剂一定，E=f（） 2）不同物质在同一波长下 E可能不同（选择性吸收-） 同一物质在不同波长下, E 一定不同 3） E，物质对光吸收能力, 测定灵敏度 4）定性、定量依据,.,续前,2 两种表示法： 1 ）摩尔吸光系数： 在一定下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度 2 ）百分含量吸光系数 /比吸光系数： 在一定下，C=1

12、g/100ml，L=1cm时的吸光度 3 ）两者关系 3. 吸光系数能否直接测得？,不能,？,？,.,六、偏离比尔定律的因素,（一）化学因素 （二）光学因素 1. 非单色光 2. 非平行光 3. 杂散光 4. 散射和反射的影响,.,（一）化学因素,Beer定律适用的另一个前提稀溶液 因浓度的改变使 C 与A关系偏离Beer定律,离解、聚合（缔合）、与溶剂作用,.,（二）光学因素,1 非单色光的影响 非单色光是指含有二种或两种以上波长的光,.,续前,.,续前,讨论： 入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状,为什么测定波长常选择在吸收峰处？,E1E2， A值减少，产生负误差; E2E1，

13、A值增大，产生误差,.,续前,2 杂散光的影响： 杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远 杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成 杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值 3 反射光和散色光的影响： 一般可用空白对比校正消除 4 非平行光的影响： 比色池要垂直放置，不同仪器测定A值不同。,.,四、透光率的测量误差 T,影响测定结果的相对误差两个因素：T和T,T 影响因素：仪器噪音 1 ）暗噪音 2 ）讯号噪音,.,续前,1 ）暗噪音与检测器和放大电路不确切性有关 与光讯号无关,.,续前,2 ）讯号噪音与光讯号有关,表明测量误差较小的范围一直可延至较高吸光度区，对测

14、定有利,.,第二节 可见-紫外分光光度计,分光光度计构成的主要部件 分光光度计的类型：,.,第二节 紫外-可见分光光度计,光路示意图,.,第二节 紫外-可见分光光度计,一、主要部件 1.光源：用于提供足够强度和稳定的连续光谱。分光光度计中常用的光源有热辐射光源 (钨灯) 和气体放电光源 (氢灯) 两类。 （ 1 ）钨灯或卤钨灯 在 350nm2500nm连续用于可见光区 （ 2 ）氢灯或氘灯 在 150nm400nm连续用于紫外光区,配稳压器,配稳流器,.,第二节紫外-可见分光光度计,2.单色器：单色器是把复合光分散后，能获得单色光的装置。,五个部分,作用：将光源发出的复色光按波长顺序分离成单

15、色光。,组成：狭缝2、准直镜2、色散元件(棱镜、光栅)。,.,单色器光路示意图,单色器的核心部分是色散元件，起分光的作用。,.,单色器光路示意图,.,3 吸收池： 玻璃能吸收紫外线光，仅适用于可见光区 石英不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区 要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）,.,4 检测器：将光信号转变为电信号的装置,5 记录装置：讯号处理和显示系统,.,1 、光电池：用半导体材料制成的，用得最多的是硒光电池。其结构和作用原理为：,硒光电池,.,光电管：它是在抽成真空或充有惰性气体的玻璃或石英泡内装上 2 个电极构成，其结构如图：,2. 光 电 管,.,红敏管 625-1000 nm

16、蓝敏管 200-625 nm,光电管,.,光电倍增管：它是一个非常灵敏的光电器件，可以把微弱的光转换成电流其灵敏度比前 2 种都要高得多。它是利用九次电子发射以放大光电流，,3.光电倍增管：,.,光电倍增管,1 个光电子可产生 106 107 个电子,.,讯号处理及显示系统,放大器,表头显示,荧屏显示,数字显示,.,二、分光光度计的类型：,.,二、分光光度计的类型： （一）单光束分光光度计：,.,特点： 使用时来回拉动吸收池 移动误差 对光源要求高 比色池配对,单光束分光光度计（ 751 ）：,.,（二）单波长双光束分光光度计,.,双光束分光光度计：,特点： 不用拉动吸收池，可以减小移动误差

17、对光源要求不高 可以自动扫描吸收光谱,.,（三）双光束双波长分光光度计：,.,3 双波长分光光度计 特点： 利用吸光度差值定量 消除干扰和吸收池不匹配引起的误差,.,第三节 紫外-可见分光光度分析方法,一、定性分析 二、纯度检测 三、单组份的定量分析* 四、多组分的定量分析-同时测定法* 五、结构分析 六、比色分析法*,.,一、定性分析,定性鉴别的依据吸收光谱 吸收光谱的形状 吸收峰的数目 吸收峰的位置（波长） 吸收峰的强度（相应的吸光系数）,.,续前,1对比吸收光谱的特征值,.,续前,2对比吸光度或吸光系数的比值,例：,.,续前,3对比吸收光谱的一致性,同一测定条件下， 与标准对照物谱图或标

18、准谱图进行对照比较,.,续前,（二）纯度检查和杂质限量测定,1纯度检查（杂质检查）,1）峰位不重叠： 找使主成分无吸收，杂质有吸收 直接考察杂质含量 2）峰位重叠： 主成分强吸收，杂质无吸收 测定结果显示为弱吸收与纯品比较，E 杂质强吸收 主成分吸收与纯品比较，E， 光谱变形,.,续前,2杂质限量的测定：,例：肾上腺素中微量杂质肾上腺酮含量计算 2mg/mL -0.05mol/L的HCL溶液，310nm下测定 规定 A3100.05 即符合要求的杂质限量0.06%,.,二、吸收度的测量（补充内容） 1. 比色皿的选择:1.玻璃;1)石英 2. 溶剂的选择: 极限波长 3. 波长的选择: 4.

19、空白对比 5. 测定步骤 1)本身调零;2)空白调零;3)测量样品 溶液的浓度A=0.20.8,.,1 吸光系数法 2 标准曲线法 3 对照法：外标一点法 4 增量法,三、单组分的定量方法,.,续前,1 吸光系数法（绝对法）,.,例：维生素 B12 的水溶液在 361nm处的百分吸光系数为 207 ，用 1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是 0.414 ，求该溶液的浓度,解：,.,练习,例：精密称取 B12 样品 25.0mg，用水溶液配成 100ml，精密吸取 10.00ml，又置 100ml 容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在 1 cm 的吸收池中，于 361 nm 处测定吸光度为

20、0.507 ，求 B12 的百分含量？。,解：,补充系数法求含量,.,续前,2 标准曲线法,过程：配制标准系列溶液 测定各标准溶液的吸收度 绘制工作曲线CA曲线求出方程 样品溶液 测定A值由方程求出浓度,.,2. 标准曲线法,.,Cx,Ax,A,0,Concentration,要 求 1. r 0.999 2. n = 5-7 3.待测浓度尽量在标准曲线中间位置,标准曲线 (A=aC+b,r),.,续前,3 对照法(外标一点法),注：当样品溶液与标准品溶液的 稀释倍数相同时,.,(三)对照法,待测样品 (Unknown sample),标准样品 (Reference sample),.,要求-

21、标准溶液的浓度应尽量接近样品浓度,.,练习,例：维生素 B12 的含量测定 精密吸取 B12 注射液 2.50mL ，加水稀释至 10.00mL ；另配制对照液，精密称定对照品 25.00mg，加水稀释至 1000 毫升在 361 nm 处，用 1 cm 吸收池，分别测定吸光度为 0.508 和 0.518 ，求 B12 注射液的浓度以及标示量的百分含量（该 B12 注射液的标示量为 100g/毫升）。,.,解： 1 ）对照法,.,练习,2 ）吸光系数法,.,续前,四、多组分的定量方法,三种情况： 1 两组分吸收光谱不重叠（互不干扰） 两组分在各自最大下不重叠分别按单组分定量,.,续前,2 两

22、组分吸收光谱部分重叠 1 测 A1 b 组分不干扰可按单组分定量测 Ca 2 测 A2 组分干扰不能按单组分定量测 Ca,.,续前,3 两组分吸收光谱完全重叠 混合样品测定,（ 1 ）解线性方程组法 （ 2 ）等吸收点法 （ 3 ）等吸收双波长消去法 （ 4 ）系数倍率法,.,（1 ）解线性方程组法,步骤：,.,2.等吸收点法,等吸收点：两物质在某波长处的吸收系数相等，该波长为,Ca=Cb,.,3 等吸收双波长法,步骤：,消除a的影响后测 b,a,b,.,续前,消去 b 的影响，测定a组分,注：须满足两个基本条件 选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点 选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大

23、,a,b,.,五、有色化合物的测定方法 光电比色法,（一）显色反应和显色剂： 1.显色反应： 在光度分析中将试样中的待测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。,.,显色反应一般分为两大类：一类是配位反应；另一类是氧化还原反应。 Fe3 SCN =FeSCN2+ ； Mn25e4H2O =MnO48H 在这两类反应中，用得较多的是配位反应。,.,（2）有机显色剂：,1）有机显色剂的优点： A.具有鲜明的颜色，都很大（一般可达到 104 以上），所以测定的灵敏度很高； B.生成的一般为螯合物，稳定性很好，一般离解常数都很小；,2.显色剂： （1）无机显色剂：,.,C.选择性好 D.有些有色配合物易

24、溶于有机溶剂，可进行萃取光度分析，提高了测定的灵敏度和选择性。,.,（ 3 ）常见的有机显色剂： 1）磺基水杨酸： 其结构式如下：,它可用于测定三价铁离子。,.,2 ）邻二氮菲（邻菲罗啉）： 结构式为：,直接在 PH = 3 9 时与 Fe2+生成红色螯合物用于铁的测定。,.,3 ）双硫腙：也叫二苯-硫腙结构式为：,测定很多重金属离子，如：铅、锌、铜、银、汞、镉等。,.,（二）对显色反应的要求： 1 定量反应；有色化合物的组成要恒定， 2 化学性质稳定。 3 显色剂的颜色与有色化合物的颜色差别要大 4 灵敏度要高； 要足够大103 105 5 选择性要好：反应的条件要易于控制。,.,（三）反应的条件：,1.显色剂用量： 显色反应就是将待测组分