普通生物化学实验-

1、生物化学基础实验教学课件生化与分子生物学实验室于乐军 实验一生物化学实验安全及技能培训 实验二Folin-wu法定量测定血糖的含量 实验三蛋白质的等电点测定及盐析反应 实验四Folin-酚试剂法测定蛋白质浓度 实验五氨基酸的纸层析 实验六醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白 实验七胰蛋白酶的活力测定 实验八酶促反应影响因素研究 实验九酵母RNA的提取及鉴定 实验十水果中维生素C的定量测定 实验十一聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳牛血清目录生物化学实验技能培训通过生物化学实验应该做到： 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。 训练实验的动手能力，学会熟

2、练地使用各种生物化学实验仪器。 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术， 为今后参加科研工作打下坚实的基础。实验室规则 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理。 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都

3、必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。 配制试剂按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收；昂贵试剂需要回收，不得丢弃。 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液 和酸性溶液，必须严密封口。 强酸强碱以及其他实验废液必须倒入废液桶。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒

4、在仪器内外和地面上。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉， 凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。Folin-Wu法定量测定血糖的含量

5、糖的重要生理功能：1.氧化供能2.人体的主要组成成分之一糖蛋白、糖脂、蛋白多糖、核糖；转化成脂肪和某些非必需氨基酸等3.糖代谢紊乱供能障碍一系列代谢变化血糖及血糖水平的概念：血糖：指血液中的单糖：葡萄糖血糖水平：血浆中葡萄糖浓度血糖总维持在恒定水平：3.96.7mmol/L血糖的来源和去路血糖测定的目的和意义临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的 主要依据。科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。v 调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。v 血糖水平异常：高血糖及糖尿病；低血糖高血糖症：指空腹血糖浓度超过7.3mmol/L,有生

6、理性和病理性之分，临高血糖症是糖尿病。最常见的病理性糖尿病：是一种慢性、复杂的代谢紊乱性疾病, 系胰岛素绝对不足或相对不足，以高血糖症为基本生化特点。同时伴有糖、脂类、蛋白质、水、电解质和酸碱平衡紊乱，甚至出现一系列并发症如眼、肾的微血管病变及神经病变等。糖尿病的诊断标准症状随机血浆葡萄糖 11.1mmol/L,或空腹血浆葡萄糖 7.0mmol/L。症状不典型者需另一天再次证实。随机血糖是指一天中的任一时间采血测得的血糖浓度。糖尿病典型的症状是“三多一少”，即多饮、多尿、多食及消瘦血糖的测定方法无机化学法： Folin-Wu法，特异性差有机化学法：邻甲苯胺法、联苯胺法、氨基联苯法干扰因素多测定

7、方法酶法：（1）己糖激酶法（HK）（2）葡萄糖氧化酶法（GOD法）特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵一、目的要求 掌握FolinWu法测定血糖含量的原理和方法。 学会制备无蛋白血滤液。 掌握7200型可见分光光度计的使用方法。二、实验原理葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性， 与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖Cu+ （Cu2O）无蛋白血滤液中的葡萄糖和酸性钼酸盐溶液共热反应, Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝

8、色钼化合物钼蓝。Cu2O+酸性钼酸试剂蓝色钼化合物OD420比色血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。三、实验仪器1、25mL血糖管3支；3、沸水浴小锅1个；5、电炉1个；7、吸耳球2个；2、血糖管橡胶塞3个；4、100mL锥形瓶2个；6、滤纸1盒；8、7200型分光光度计1台;7200型分光光度计血糖管四、实验试剂1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。2、10%

9、钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。4、碱性硫酸铜溶液A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml.B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4）。四、实验试剂5、酸性钼酸盐溶液：称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀， 静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入

10、225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。五、实验步骤1、无蛋白血滤液的制备：用5ml移液管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血 液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。再加0.33mol/LH2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置515分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/LH2SO41-2滴）。用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤

11、 液相当于1/10ml全血。2、血糖的定量测定：取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸 管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。六、结果计算：标准管（A0）样品管（ A1空白管）OD420 OD420 OD420OD平均0000按下式计算100ml全血中所含血糖的含量m=A1/A

12、0C00.1100式中: m=100ml全血中含血糖毫克数 ; C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml）；A1=样品液光吸收值 ; A0=标准液光吸收值0.1：1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血注意事项：1.加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性沉淀，如果沉淀不变暗棕色或重新过滤后仍混浊，是因为血液中所加抗凝剂过多，可以加入10硫酸1-2滴，待暗棕色后再过滤。3.用定量滤纸过滤后应该得到完全澄清无色之无蛋白血滤液。如果得到仍带有红色的血滤液则说明蛋白质未被完全去除。【思考题】1、实验过程中那些操作可能影响实验结果的准

13、确性？2、实验中，血糖管有什么作用？3、实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？五、实验步骤 1、无蛋白血滤液的制备：用5ml移液管取全血1ml（已加抗凝剂蒸馏水7ml 摇匀 20ml锥形瓶溶血(变为红色透明)10%钨酸钠1ml 放置515分(沉淀变为暗棕色)0.33mol/L H SO 1ml 24边加边摇,加毕充分摇匀摇匀(如不变色,再加0.33mol/L H SO 12滴 )24无蛋白血滤液(每毫升相当于1/10ml全血)干滤纸过滤 2、血糖的定量测定：m=OD1/OD2 C 10 1001号管2ml蒸馏水2ml新配制的碱性硫酸铜溶液同时置于沸水浴中8min， 取出

14、在流水中迅速冷却4ml酸性钼酸盐溶液一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml， 混匀用7220分光光度计在420波长处比色,以空白管调节零点2号管2ml标准葡萄糖液3号管2ml无蛋白血滤液分光光度计的工作原理朗伯-比尔定律朗伯定律：A=k1L 比尔定律：A=k2C朗伯-比尔定律：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。A=KLC 朗伯-比尔定律应用A标=KC标LA样=KC样LA样C = C样A标标标准品法测定未知样品含量7200型分光光度计的操作程序连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。接通电源，使仪器预热20分钟。用键设置测试方式：投射比

15、（T），吸光度（A）， 已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F） 方式。用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。将参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中， 打开样品室盖，将盛有溶 液的比色皿分别插入比色 皿槽中，盖上样品室盖。 一般情况下，参比样品放 在第二个槽位中。将0T校具（黑体）置入光路中，在T方式下按“0T”键，此时显示器显示“000.0”按MODE键选择A模式将参比样品拉入光路中，按“0A/100T”键调0A/100T，此时显示器显示的“BLA”直至显示“0.000”A为止。当仪器显示器显示出“0.000”A后，将被测样品推入光路，这时，您便可从显示器上得到被测样品的吸光

16、度。分光光度计的使用注意事项:比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此，特别要将比色皿清洗干净。装样前处理：自来水反复冲洗蒸馏水漂洗2次待装溶液漂洗2次。用完后用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿盒中。拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”。 毛面 光面若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干，以保证吸光度测量不受影响。比色皿内盛液应为其容量的2/3，过少会影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。 光透过窗口 比色皿的光面要与光源在一条线上。容量的2/3蛋白质的等电点测定及盐析反应I. 蛋白质等电点测定一、目的：了解蛋白质的解离性质学习测定蛋白质等电点的一种方法二

17、、原理：蛋白质是电解质，在溶液中存在如下平衡：+ OH-+ H+NH2COO-+ OH-+ H+NH+NH3+Pr3PrPrCOO-COOHpH pI净电荷为负蛋白质等电点：当蛋白质颗粒上正负电荷数目相等时溶液的pH值。处于等电点时的蛋白质在电场中不发生移动；处于等电点时的蛋白质溶解度最低。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向缓冲液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。三、器材1. 水浴锅2. 温度计3.200毫升锥型瓶4.100毫升容量瓶5. 吸管6. 试管7. 试管架8. 乳钵四.试剂:1. 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液：称取

18、0.4g酪蛋白，置于100ml烧杯中，用少量50左右蒸馏水溶解，再加入10ml1mol/L乙酸钠溶液。把烧杯放到50水浴中，小心搅拌至其完全溶解。将烧杯内的溶液全部转移至100ml容量瓶中，定容。2. 1.00mol/L醋酸溶液3. 0.10mol/L醋酸溶液：取1.00mol/L醋酸溶液，稀释10倍。4. 0.01mol/L醋酸溶液:取0.10mol/L醋酸溶液，稀释10倍。五.操作方法1.取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂然后混匀管号蒸馏水（mL）0.01mol/L醋酸( mL）0.1mol/L醋酸(mL) 1.0mol/L醋酸(mL) 18.40.60028.700.3

19、038.001.0047.4001.62.向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。或者振摇1min后，在分光光度计550nm处测定光密度值。六.等电点测定实验结果 几号管最混浊,溶液pH为?由于等电点时蛋白质溶解度最小,所以酪蛋白的等电点为? 或记录各管的OD值，并以OD值对PH值作图，得光密度-PH值曲线，曲线最高点对应的pH即为酪蛋白等电点蛋白质的盐析反应一、目的：1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2. 了解蛋白质变性

20、与沉淀的关系。一、实验原理蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大 小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相 对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性， 蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。（1） 可逆的沉淀的反应：蛋白质不变性（2） 不可逆沉淀反应：蛋白质变性无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而 清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐 析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓

21、度时， 又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。二、实验仪器1、移液管2、吸管3、试管三、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍，3-4层 纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。2、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。四、实验操作1、取试管1支，加入蒸馏水5ml，然后加固体硫酸铵(加的过程要缓慢，加的量要少随时摇匀），直至其饱和，备用。再取试管1支，加入蛋白液5ml，然后将上述配制的等 量硫酸铵饱和溶液加入，摇匀静置数分钟，观察有无球蛋 白析出。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解， 为什么？2、将上述混合液过滤。向滤液中逐渐加入少量固体硫酸铵（每次加入量约为米粒大小），边加边摇，直至不在

22、溶解为止，观察有无清蛋白析出。再加入少量蒸馏水，观察 沉淀是否溶解。【思考题】1、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？2、 蛋白质的沉淀与变性的关系？福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功 能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白 质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目

23、前 测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据 蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法化学性质：凯氏定氮法、双缩脲BCA法，胶体金法owry 法，染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法其他性质：荧光法方法测定范围（g/ml）不同种类蛋白的差异最大吸收波长(nm)特点凯氏定氮法小标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光度法1001000大280205灵敏，快速，不消耗样品，核酸类物质有影响双缩脲法100010000小540重复性、线性关系好，灵敏度低，测定范围窄，样品需要量大Folin- 酚试剂法20500大750灵敏，费时较长，干扰物质多考马氏

24、亮蓝G- 25050500大蛋白595质不灵敏度高，稳定，误差较大，颜色会转移同方法比较BCA50500大562灵敏度高，稳定，干扰因素少，费时较长一、实验原理蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生 成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正 比，可用比色法测定。此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较 紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色， 并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。二、实验仪器1.卵清蛋白片3.试管三、实验试剂2.7200分光光度计4.移液

25、管1. Folin-酚试剂A：碱性铜溶液甲液：取Na2CO32g溶于100ml0.1mol/l氢氧化钠溶液中乙液：取CuSO4.5H2O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100ml中。 临用时按甲：乙=50：1混合使用。2. Folin-酚试剂B：将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700ml蒸馏水、50ml85%磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回馏10小时，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50ml及液溴数 滴，开口煮沸15分钟，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000ml，过滤，滤液成微绿色，贮于棕色瓶中。临用时，用1mol/l的 氢氧化钠溶液滴定

26、，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至 相当于1mol/L的酸。3.1mg/mL牛血清蛋白液：称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000ml四、实验步骤1. 标准曲线的绘制取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂， 比色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2. 样品测定准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下 表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求出样液的蛋白质浓度。管号1234567样品牛血清蛋白液(1mg/ml)ml 蒸馏水mlFolin-酚试剂A00.54.00.050.454.00.10.44.00.20.34.00.30.24.00.40.

27、14.00.504.00.5（样液）04.0摇匀，在室温下放置10分钟Folin-酚试剂B0.50.50.50.50.50.50.50.5摇匀，在室温下放置30分钟后在640nm下比色OD640【注意事项】1、Tris缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、等均会干扰Folin-酚反应。2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加管摇一管）以免出现浑浊。3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光 红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选

28、用波长640nm。【思考题】蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优缺点？附：标准曲线EXCEL表制作：1、将浓度和所测OD值输入到EXCEL表中。2、将数据区域全部选中。3、点击“图表向导”键。4、在图标类型中选择“XY散点图”，然后点击第一个图。5.点击“下一步”。6、在“图表选项”的“标题”中，于选中的红域内可以填入相应的名称。然后点击“完成”。7、鼠标点住数值点，右键单击，选择”添加趋势线”8、在“添加趋势线”对话框中选择“线性”分析类型，然后点“确定”。9、点住直线右键单击，点“趋势线格式”，对标准曲线进行编辑。10、在“选项”中勾选“显示公式”和“显示R平方值”两项，点“确定”11、

29、曲线上会显示出此标准曲线的回归方程和R2，将样品测得的OD值（即Y值） 代入方程，就得出样品的浓度（即X值）。这里的R2表示标准曲线的线性，即R2越接近于1， 你所测的数值越准确，也 越具有说服力。一般要求 至少R2=0.99以上为好。氨基酸的纸层析层析技术介绍一、定义层析技术(chromatography）也称色谱技术，是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方 法。具体的说是根据被分离的混合物中各组分的理化性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、 分配系数等）的不同，使各组分在两相（一相为固定的， 称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中进行分配以获得分离的

30、方法。固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可 以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液）。流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。二、层析技术的原理层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另 一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组 分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶 解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不 同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再 分

31、配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。三、发展简史层析分离技术在20世纪初就已得到应用： 1903年用于植物色素的分离,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法” 1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体； 1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析； 20世纪六十年代末出现了高效液相色谱(HPLC)。四、层析技术的种类按层析的机理划分：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、 亲和层析等。吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系

32、数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作 用的不同。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。这两大类层析是以流动相不同来划分的。如同时区分流动 相和固定相，划分为：气固层析、气液层析、液固层析和 液液层析等。按操作形式划分：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开， 以达到分离鉴定的目的。薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。一、实验目的1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析的原理和操作技术；2、掌握分配层析法；3、掌

33、握影响分配系数的因素。二、实验原理纸层析法：是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附水作为固定相，通常把有机溶剂作为流动相。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同， 不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨 基酸分离开来，形成距原点不等的层析点。分配层析法：利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。在 一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数 是一个常数。溶质在固定相的浓度(Cs)分配系数=溶质在流动相的浓度（Cl)溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3

34、：2固定相：水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相;流动相：有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相。由于混合液中各种氨基酸的值不同，所以移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。移动速率(比移值)：原点到层析点中心的距离Rf=原点到溶剂前沿的距离影响Rf值的主要因素：Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf也就 不同。（1）物质的结构和分子极性：物质的结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之

35、间的分配系数， 极性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之,Rf则较大。（2）层析溶剂：首先，溶剂的纯度要高。其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中 的Rf在0.050.85。再次，溶剂系统必须新鲜配制，如正丁醇-久放易引起酯化。甲酸-水系统（3）pH值：溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影 响物质的极性和溶解度，使Rf改变；（4）滤纸：层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂 所饱和。不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同， 因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同， Rf也不同；另

36、外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.010.4M的HCl处理除去金属离子）.（5）室验室的温度和时间:温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用从而影响固定相的体积；也影响溶 剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例。层析必须在恒温条件下进行。（6）展开方式：上行法Rf小；下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽，滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）Rf大；环行法（最好用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。（7）样品溶液中杂质：如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。二、实验仪器1、新华滤纸5、橡皮筋

37、2、层析缸3、细线4、点样管6、电吹风7、喷雾器三、实验试剂1、混合氨基酸（甘氨酸，苯丙氨酸）2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮无水溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水，贮于棕色瓶中四、试验步骤1、取滤纸剪成2010厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端23cm处用铅笔画一横线，在 线上画两个点（原点）。2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液和甘氨酸标准液，在上面两个点处点样，样点直径不宜超过5mm, 每点一次用吹风机吹干，点23次为佳。3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸

38、璧上，当展层至另一端12cm 处时，停止展层（大约23小时）。4 、取出滤纸， 用铅笔记下溶剂前沿， 然后用热风吹干（或烘箱60）烘干。5、均匀喷上茚三酮无水不间断。液，注意使溶液不倒流，6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。五、实验结果与计算：1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算 各种已知氨基酸和未知氨基酸的Rf值。【思考题】1、分析影响分配系数的因素有哪些？2、何谓分配层析法，分配系数？醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白电泳技术：电泳(electrophoresis) ：带电粒子在电场中向与其电性相反的电极方向泳动的现象。带负电粒子正极负

39、极带正电粒子电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳法：利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的方法和技术。在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。 1809年，现电泳现象；物理学家Pece首次发 1937年，KaurinTiselius发明了Tiselius电泳仪，建立了自由界面电泳， 首次证明人血清蛋白的组分； 1948年，Wieland和Fischer以滤纸作为支持介质的电泳； 1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成

40、凝胶作为介质聚丙烯酰胺凝胶电泳: 生物大分子的“ L a s tCheck”！Kaurin Tiselius (1902- 1971)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖1948诺贝尔生理医学奖。（） （+）+-表面带负电荷+ 带正电荷的水层（）（ + ）+表面带正电荷-带负电荷的水层电泳的影响因素：1、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度 溶液的pH值溶液的离子强度电渗现象2.影响电泳迁移率的内在因素： 质点所带净电荷的量质点的大小和形状电泳的分类: 根据电泳中是否使用支持介质分为：自由界面电泳区带电泳 根据电泳系统pH是否连续分为：连续pH电泳不连续pH电泳 按支持物

41、的装置形式不同分为：水平板式电泳垂直板式电泳垂直柱式电泳 根据电泳物质类别不同分为：细胞电泳，核酸电泳，蛋白质电泳等 按其介质的物理性状不同可分为：凝胶电泳粉末电泳线丝电泳纤维膜电泳等一、实验目的1.了解醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的操作步骤3.熟悉电泳仪器的使用和操作。二、实验原理1.醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。2.血清中各种蛋白质的等电点在pH4.07.3之间，在pH8.6的缓冲溶液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。血清中各种蛋白质的等电点不同，所以带电荷量也不同。此外各种蛋白质的分子大小各有差异，因此在同一电场

42、中泳动的速度不同。分子小而带电荷多者，泳动较快；反之，则较慢。血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、1、2、五条区带。蛋白质名称等电点分子量清蛋白4.88690005.061200000 23000005.12900001500006.857.501560003000003.醋酸纤维素薄膜纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。具有均一的泡沫状结构（厚约120m

43、m），渗透性强， 对分子移动的阻力很弱。用其作支持物进行电泳，具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品附现象等优点。现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。三、实验仪器1、2、3、4、5、6、牛血清醋酸纤维薄膜镊子电泳仪电泳槽盖玻片三、实验试剂1、巴比妥巴比妥钠缓冲液（离子强度，PH8.6）：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。用pH计较正后使用。2、染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸馏水40ml混匀即可。3、漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸馏水50ml混匀即可。四、实验步骤1.薄膜

44、准备 将薄膜置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，浸泡30 min以上，方可用于点样注意：整条薄膜颜色一致而无白色斑点，则表明薄膜质地均匀(实验中应选择质地均匀的膜)。 用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间吸干多 余的缓冲液，然后平铺在桌子上（毛面朝上）注意：不要将薄膜吸的太干，否则电流无法通过；也不要太湿， 点样时容易扩散。2.点样：用点样器蘸取少量血清，以法点样。注意： 点样处距离膜边缘约1.5cm处，位置居中点样时，轻压1-2S，使血清渗透到薄膜内点样只可一次，不能重复点样 点样要求：细、直、不接触边缘3.上样： 连接电泳仪和电泳槽 根据电泳槽膜支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条制作滤 纸桥 将

45、薄膜毛面朝下，点样端朝向负极置于滤纸桥上（注：不可让点样处接触滤纸桥） 排空膜上的气泡4. 电泳： 平衡：盖上电泳槽盖，平衡5min至膜完全湿润电泳：稳压，110V，约1.5h（至第一条带到达膜条2/3处为止）5.染色及漂洗： 染色：用镊子将膜条夹至氨基黑10B中染色10min.注意：薄膜条要完全浸入染色液且每条要分开，不重叠 漂洗：染色完毕，将薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景无色，再浸入蒸馏水中。注意：漂洗薄膜时，请做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂 洗薄膜，多漂几次，这样既不浪费漂洗液，还达到了漂洗的效果。六、透明将薄膜用滤纸吸干或吹风机吹干，浸入透明液完全干燥后，薄膜完全透明，可作扫

46、描描或照相，将该玻璃板浸入水中，则透明的薄膜可脱下，吸干水分可长期保存。（不做）五、记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上的几条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置 进行描述、记录在实验报告上，并判断分析其结果。正常参考值：实验结果：清蛋白57.45-71.73%a1-球蛋白1.76-4.48%a2-球蛋白 4.04-8.28%-球蛋白 6.79-11.39%-球蛋白 11.8522.97%A/G1.24-2.36注 意 事 项：v 1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电 泳图谱出现条痕。v 2、缓冲溶液

47、离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过 小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。v 3、电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交 替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。v 4、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。【思考题】1、影响醋酸纤维薄膜电泳的因素有哪些，其是如何影响的？2、实验过程中哪些操作会影响到实验条带的完整性，应该如何改正？其他主要电泳技术介绍：1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳常用于蛋白质分子量的测定，有垂直板、平板、盘状电泳2、等电聚焦电泳：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质。3、双向凝胶电泳：蛋白质组学研究的重要技术。4

48、、琼脂糖凝胶电泳：分离DNA或RNA分子胰蛋白酶活力测定酶的定义是一类生物催化剂。是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。酶的化学组成蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)全酶(holoenzyme)小分子有机化合物金属离子辅助因子(cofactor)辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）辅酶(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。辅基(prosthetic group):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。酶的活性中心必需基团：酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。活性中心：酶分子中必需基团相对集中，构成一定空间结构区域

49、，与催化作用直接相关。结合部位（底物）活性中心催化部位（底物的键在此处形成新的键）断或底 物活性中心以外的必需基团催化基团结合基团活性中心酶的活力酶活力（enzyme activity）：是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力单位（国际单位）：标准状态下，每分钟使一微克分子作用物发生转变的酶量。人们普遍采用是习惯用法，如a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表示。一、实验原理福林酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼 蓝）。蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨 酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸 与福林酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围 内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。二、实验仪器试管7200分光光度计恒温水浴锅三、实验试剂1.福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测