不同工艺处理的烟草中游离态氨基酸含量分析研究

1、不同工艺处理的烟草中游离态氨基酸含量分析研究王蕾1，孟广宇2，于瑞国1，郗继忠2， 韩杰锋1，李荣1（1澳华达国际香料（广州）有限公司）（2将军烟草集团有限公司）前言烟草中含氮化合物对烟草的感官评吸质量和吸者健康都有重要的影响，历来受到人们的关注。氨基酸含量与烟草的 品质有着密切的关系，是重要的致香前体物质。烟草中氨基 酸有20余种。中性氨基酸有：甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、-氨基丁酸、蛋氨酸、半光氨酸、亮氨酸、异亮氨酸 等，酸性氨基酸有：天门冬氨酸、谷氨酸；碱性氨基酸有： 苯丙氨酸、酪氨酸；杂环氨基酸有色氨酸、组氨酸、脯氨酸、羟氨酸。在烟草调制、醇化或发酵、加工乃至燃烧过程中， 游离氨基

2、酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色反应。前言生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸还可以自解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。烟草加工过程特别是不同工艺处理所产生的氨基酸变化研究未见报道。本试验针对同一年份同一等级的几个不同地区的三种工艺处理后的烟叶样品中游离态氨基酸进行分析研究。开展此类研究对烟草在加工过程中香味物质损失的控制与补偿有着积极的指导意义。1. 实验部分1.1 材料与试剂材料：选取三个地区，同一年份同一等级理工艺的烟叶作为样本。不同处仪器：HP1100型高效液相色谱仪；旋转蒸发仪）；超声波萃取仪（自制）；固相萃取

3、仪；微波炉。试剂：氨基酸标样，邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯，硼酸缓冲溶液；三乙胺、四氢呋喃、二次蒸馏水。1.2样品制作1.2.1工艺处理选取的烟叶样品先进行水分调节，控制在1618之间后切丝。将烟丝分别进行薄板干燥和高温气流干燥工艺处理。主要工艺参数见表1。待参数稳定后取样，且取样数3次。将其混合均匀后从中取出一定数量得到实验室样品。表1样品制作主要工艺参数高参数工艺名称入口水分（%）热风温度（）薄板气流干燥26125温气流干燥（HXD）282951.2.2样品处理准确称取一定量的样品于干燥洁净试管中，用一定比例一定体积的乙醇水溶液在室温下用微波萃取。滤液经活化的离子交换萃取柱并经离心分离、过滤后

4、，用HP1100液相色谱仪进行分析。1.3柱前衍生化用自动进样器吸取5.0l的硼酸缓冲液，再吸取1.0l的OPA，冼针一次，再吸2.0l样品，再冼针一次，原位混合8次，吸取1.0l FMOC，冼针一次，再在原位混合5次，进样。1.4液相色谱条件色谱柱：Hypersil AA-ODS C18（2.1mm200mm）；流动相A：（1.350.025）g三水合醋酸钠，加入500ml纯水溶解，加90l三乙胺，用2%醋酸调PH=7.300.05，再加入1.5ml四氢呋喃，混合均匀；流动相B：（1.350.025）g三水合醋酸钠，加入100ml 纯水溶解，用2%醋酸调PH=7.300.05，再加入200m

5、l甲醇、200ml乙腈，混合均匀；流速：0.45ml/min；柱温：38；荧光检测波长为： 激发，340nm；发射，450nm；PTM增益为12；14.5分钟开始：激发，266nm；发射，305nm；PTM增益为11。梯度：100%A，17分钟时60%B，18分钟时100%B， 18.1分钟时流速0.45，18.5分钟时流速0.8，23.9分钟时流速0.8，24分钟时100%B，流速0.45，25分钟时0%B。1.5氨基酸的定性、定量分析对应标样谱图，应用保留时间进行定性。以正缬氨酸为内标物，采用内标法进行定量。2.结果与讨论2.1烟叶中游离态氨基酸萃取方法选择2.1.1超声波2.1.2微波2

6、.1.3方法选择浸取又称固液萃取，是利用液体提取目标产物的扩散分离操作。但传统的萃取手段存在：时间长；光、热不稳定；溶剂/样品量比大等不足。微波协助萃取及超声协助萃取技术是新型的萃取技术，具有快速、高效、高选择性、对环境友好等特点。经微波萃取与超声波萃取的试验比较 表明，微波萃取比超声萃取在样品量、萃取时间、萃取回 收率等方面有明显的优势（见表2）。本试验确定样品处理采用微波协助萃取。表2：微波萃取与超声波萃取的比较指标超声波法微波法样品重量/g5300.51.0溶剂体积/ml3001020时间60min1min2.2微波萃取条件的优化2.2.1萃取剂的选择：在微波协助萃取中，应尽量选择对微波

7、透明或部分透明的介质作为萃取剂，也就是选择介电常 数较小的溶剂。水、乙醇、稀酸溶液等都对氨基 酸都有效好的溶解能力。我们选取了纯水、50% 乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇和0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l盐酸水溶液进行萃取，因为水是介电常数效大的物质， 所以在萃取过程中用盐酸水溶液得不到很好的萃 取较果，结果表明50%乙醇水溶液在微波协助萃 取中能达到满意的提取效果。2.2.2萃取作用时间的影响：一般微波协助萃取辐射时间在10100S之间为最佳，对于不同的物质萃取的时间不同，但连续辐射的时间不可以太长，否则容易引起溶剂沸腾。本实验所

8、用的样品量为1g，经试验确定采用短时间多次的方式进行。萃取时间控制不超过一分钟，且分三次完成。回收率采用标样加入法测定回收率，混合标样加入量为0.200 mg/g。结果见表3，结果表明，除了丝氨酸、甘氨酸和和酪氨酸的回收率低于90%，其于各类氨基酸的回收率均在90%以上，说明该方法测定氨基酸的结果是比较准确的。表3氨基酸回收率氨基酸英文缩写样品含量（mg/g）测定量（mg/g）差值（mg/g）回收率（%）天门冬氨酸Asp0.1150.3170.202101谷氨酸Glu0.2140.4080.19497丝氨酸Ser0.0980.2760.17889组氨酸His0.120.3110.19195.5

9、甘氨酸Gly0.0540.2240.1785苏氨酸Thr0.0760.2570.18190.5丙氨酸Ala0.2890.4870.19899精氨酸Arg0.0290.2110.18291酪氨酸Tyr0.0880.2670.17989.5胱氨酸Cys-SS-Cys0.1880.3790.19195.5缬氨酸Val0.0750.2650.1995蛋氨酸Met0.1570.350.19396.5苯丙氨酸Pho0.0690.2550.18693异亮氨酸Ile0.0370.2290.19296亮氨酸Leu0.0560.2460.1995赖氨酸Lys0.0880.2760.18894脯氨酸Pro2.126

10、2.330.204102工作曲线及其线性范围取浓度为2、4、5、8、10、25 和50 pmol/L的氨基酸混合标样各2L，分别加入等体积的5 pmol/L的内标溶液，进行HPLC分析。再以氨基酸浓度为横坐标，氨基酸与内标的色谱峰峰面积之比为纵坐标作图，得到各个氨基酸的工作曲线，其线性方程如表4所示。从表4可以看出，各氨基酸在250 pmol/L的浓度范围内均有良好的线性。表6氨基酸的工作曲线氨基酸amino acids线性方程linear formulas相关系数correlation coefficients天门冬氨酸（Asp）y=9.80639004x+1.23292920.99723谷

11、氨酸（Glu）y=12.5367764x+3.02037590.98994丝氨酸（Ser）y=7.33699499x+1.72263570.99043组氨酸（His）y=6.00611627x+0.74365910.99731甘氨酸（Gly）y=10.7398785x+2.75115180.98864苏氨酸（Thr）y=8.15963256x+1.07289250.99697丙氨酸（Ala）y=8.92328513x+1.16821830.99426精氨酸（Arg）y=9.82037762x+0.72467440.99904酪氨酸（Tyr）y=9.33618621x+0.61865320.99

12、923胱氨酸（Cys-SS-Cys）y=2.01515573x+0.40745580.99288缬氨酸（Val）y=10.566229x+1.39321740.99695蛋氨酸（Met）y=10.2072218x+0.54338380.995苯丙氨酸（Phe）y=10.2511548x+0.4989810.99958异亮氨酸（Ile）y=10.8870175x+1.184570.99792亮氨酸（Leu）y=10.4527193x+1.5722650.99604赖氨酸（Lys）y=4.14379223x+0.68575670.99521脯氨酸（Pro）y=6.91295685x+3.35314

13、930.960992.4烟丝经不同工艺处理后游离氨基酸的变化分别选取2002年产等级为C3F的云南、河南和贵州烟叶作为样本，按1.2所述步骤进行处理分析，从图1、2、3可以看出：生丝分别经薄板干燥和高温气流干燥后氨基酸的含量均呈现不同程度的下降。其中以高温气流干燥处理的下降尤为明显。图1云南烟丝不同工艺处理的液相色谱图2河南烟丝不同工艺处理的液相色谱图3贵州烟丝不同工艺处理的液相色谱不同的氨基酸对工艺处理的敏感程度表现不一，表5所列为变化较显著的几种。该结果与文献报道基本吻合。氨基酸生丝（mg/g）处理后(mg/g)变化（）天门冬氨酸0.1151薄板干燥0.0713-38高温气流干燥0.051

14、8-55脯氨酸2.126薄板干燥1.2756-40高温气流干燥0.4252-80赖氨酸0.0882薄板干燥0.0309-65高温气流干燥0.0088-90组氨酸0.1203薄板干燥0.0553-54高温气流干燥0.0096-92精氨酸0.0296薄板干燥0.0124-58高温气流干燥0.0266-91不同地区的烟丝经工艺处理后游离氨基酸的变化同样表现出不同的差异。薄板干燥处理后烟丝的氨基酸变化不明显，除精氨酸和脯氨酸等几种有一定的下降外，大多数的变化不明显。而高温气流干燥处理后烟丝的氨基酸则表现出特征性差异。河南烟丝相对表现稳定，组氨酸、脯氨酸下降明显；云南烟丝的游离氨基酸变化显著，下降明显，有些氨基酸的下降高达90如：组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸。3结论3.1 用高温气流干燥处理烟丝，某些特定的氨基酸含量有所下降。提示我们在除杂、降刺改善内在品质的同时，同样亦会带来可能存在的某些特定物质的损失。3.2 微波协助萃取分