利用厌氧型细菌治疗肿瘤的研究 - 副本

1、利用厌氧型细菌治疗肿瘤的研究摘要随着肿瘤抗药性等问题的不断出现，厌氧菌对实体瘤的溶瘤作用引人关注。本文利用了厌氧型细菌在实体瘤治疗中存在的优势及问题，由于肿瘤的乏氧区不存在肿瘤特异性，因此以厌氧型细菌为载体的肿瘤分子靶向治疗方案，可以有效克服传统化学治疗的不良反应和抗体或小分子药物分子靶向治疗的缺陷，使实体瘤内存在的乏氧区不再成为肿瘤治疗的禁区。以及进行体外实验和以喂食、静脉注射和直接注入实体瘤部位的方法来测定细菌的抗瘤效果以及未来的发展前景。关键词厌氧菌；抗肿瘤；溶瘤作用；肿瘤治疗一、 摘要随着肿瘤抗药性等问题的不断出现，厌氧菌对实体瘤的溶瘤作用引人关注。本文利用了厌氧型细菌在实体瘤治疗中存

2、在的优势及问题，由于肿瘤的乏氧区不存在肿瘤特异性，因此以厌氧型细菌为载体的肿瘤分子靶向治疗方案，可以有效克服传统化学治疗的不良反应和抗体或小分子药物分子靶向治疗的缺陷，使实体瘤内存在的乏氧区不再成为肿瘤治疗的禁区。以及进行体外实验和以喂食、静脉注射和直接注入实体瘤部位的方法来测定细菌的抗瘤效果以及未来的发展前景。二、 立题依据肿瘤是一种基因病，但并非是遗传的。它是指细胞在致瘤因素作用下，基因发生了改变，失去对其生长的正常调控，导致异常增生。可分为良性和恶性肿瘤两大类。前者生长缓慢，与周围组织界限清楚，不发生转移，对人体健康危害不大。后者生长迅速，可转移到身体其它部位，还会产生有害物质，破坏正常

3、器官结构，使机体功能失调，威胁生命。早在150年前趋乏氧区定植和增殖且非致病性的厌氧菌就开始被用于肿瘤治疗1， 当实体肿瘤存在的时候，肿瘤局部将出现一些与正常组织不同的微环境的改变，使细菌的繁殖成为可能2。其中肿瘤细胞的快速增殖性也给厌氧菌创造了微环境，使得用厌氧菌治疗肿瘤成为了可能。在十九世纪初，Vaultier 就观察到肿瘤患者发生细菌感染后肿瘤消退的现象。1868年，德国外科医生W. Busch 开始在小范围内尝试用化脓性链球菌感染来治疗肿瘤3。1976 年，Morales 等将卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG） 治疗表浅膀胱肿瘤，此局面才有所扭转。直到今

4、天，在许多国家BCG仍用于治疗表浅膀胱肿瘤4。实践已经证明了利用厌氧型细菌治疗肿瘤的可行性，将细菌用于肿瘤治疗不是新观点。三、 研究方案1 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题本课题旨在探索厌氧型细菌在因快速增殖的肿瘤而造成的无氧环境下细菌的生长状况以及肿瘤组织被细菌破坏的程度。肿瘤能逃避机体免疫系统是发展肿瘤免疫治疗的主要障碍, 使细菌侵入恶性瘤细胞，使细胞递呈细菌抗原决定簇5。实体肿瘤的独特病理生理特点使传统抗肿瘤治疗方法受到挑战，同时也给厌氧菌提供了机会6。其原因在于肿瘤的生长速度超过了其血管的生成速度，在实体瘤区形成的血管不足以提供整个瘤体所需的氧7。单独使用厌氧菌仅能延缓肿瘤的生长，

5、不能达到彻底根除，肿瘤会由周边残存的细胞复发8。为在将细菌注入机体时，细菌会刺激机体产生免疫应答，导致注入的细菌失活，但对于初次细菌的患者，其治疗效果相对于再次接触同种细菌的效果好。因此，必须要细菌侵染肿瘤和细菌免受机体免疫系统的攻击之间寻找平衡点。利用肿瘤乏氧区域这一特征，具有广阔的发展前景，目前已取得了初步的结果，但仍有诸多问题需要解决9。其中，还有三大关键问题10：其一，乏氧区远离血管难以获得有效的药物浓度；其二，治疗必须特异地针对乏氧细胞，对不缺氧正常组织细胞无损害；最后，要攻击的乏氧肿瘤细胞常常已停止分裂。但血供较为丰富的边缘存活肿瘤细胞仍可造成肿瘤复发11。还有细菌感染后期，将细菌

6、从机体内清除的关键性难题。2 采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法：采用细胞培养技术以及基因工程技术技术路线：厌氧菌在肿瘤治疗中的应用主要表现为直接溶瘤效应、治疗基因载体及联合溶菌疗法等几个方面。本课题旨主要是直接溶瘤效应。实验方案：如图取一块无限增殖的癌组织观察肿瘤组织生长状况接种厌氧型细菌筛选出发生溶瘤部位的菌种分为三种方式注入小鼠体内静脉注射喂食直接注射肿瘤部位观察溶瘤效果观察溶瘤效果观察溶瘤效果可行性分析：由于厌氧菌在肿瘤低氧坏死区内选择性定植生长，使基因治疗面临的缺乏特异性基因治疗载体的问题有了新的希望，其对肿瘤的选择性远远强于病毒载体。静脉给菌后双歧杆菌、沙门氏菌

7、、梭菌均被证明可优先在实体瘤的厌氧区内生长繁殖，也不排除可能存在某些粘附分子使得厌氧菌具有肿瘤靶向性12。肿瘤逃避免疫是其难治愈的又一关键。许多厌氧菌能促进机体对其靶向定植肿瘤的免疫识别和应答13。专性或兼性厌氧菌能在肿瘤组织内定植，可成为新的抗肿瘤治疗方式14。肿瘤组织内部特殊病理生理特点和厌氧菌自身的生物学特性是厌氧菌抗肿瘤应用研究的基础15：肿瘤细胞生长快，而瘤内血管形态不规则、分支紊乱，实体肿瘤内部形成乏氧微环境，有利于厌氧菌靶向定植于肿瘤组织；肿瘤组织代谢旺盛，产生大量代谢产物，可供厌氧菌利用，厌氧菌在瘤内比正常组织具备更强的增殖能力，更易在肿瘤内富集；肿瘤内异常血管化和肿瘤组织间隙

8、的高压使瘤内免疫细胞、抗体、补体等数量减少且功能受到抑制，厌氧菌在瘤内较难被免疫系统识别、清除；某些厌氧菌为益生菌或无致病性，致病性厌氧菌所致的继发性感染可通过抗生素得到较好控制；厌氧菌基因容量较大，可进行基因修饰，具备稳定表达外源基因的能力，是良好的基因载体；厌氧菌的安全性较高，便于保存，无潜在的长期副作用。理想厌氧菌的特点有1, 16：对宿主无毒性；高度的肿瘤靶向性；广泛的肿瘤实用性；具有繁殖能力并高效表达外源基因；可全身运用；本身即具溶瘤作用；具有运动能力，可分布于整个乏氧坏死区；治疗后可彻底清除(通过少量敏感抗生素或机体缓慢清除)。异常的血管化和肿瘤组织间隙的高压阻止免疫成分随血流进人

9、肿瘤组织，形成免疫防御真空区为细菌提供了生存保护17。再就是肿瘤组织旺盛的代谢产生的大量中间产物也成为某些营养缺陷型工程厌氧菌生存的有利条件18。不易被免疫监视和免疫防御系统破坏，某些厌氧菌本身具有的抗瘤作用19等优点。3 项目的特色与创新之处项目的特色：利用细胞培养技术以及基因工程技术等多种技术结合，筛选出具有溶瘤较好的细菌，以及选出最适细菌浓度。创新之处：对于肿瘤的快速增殖而导致的缺氧环境有利于厌氧菌生长。而厌氧菌具有竞争和侵染肿瘤细胞的能力。4 年度研究计划及预测进展本课题拟在3年内完成，各阶段主要任务如下：2016年6月2017年6月，进行第一期试验，掌握第一批基本数据，找出试验过程中

10、出现的问题，并就大多数数据进行初步理论分析。 2017年6月2018年6月，对第一期试验过程中出现的问题进行矫正，完善课题的每一个步骤，顺利完成该年度试验（第二期试验），得出可靠的数据，进行数据整理和理论分析。 2018年6月2019年6月，对前两年所得结果中不合理的数据进行分析，通过重复试验验证来矫正和更新，并就新发现的一些问题进行补充试验。最终顺利完成本课题。预测进展:四、 研究基础1 前期工作查阅了大量的综述文献。2 实验条件目前，依托开放实验室现有仪器设备，合理的开放制度能够让研究人员随时进入实验室，提高研究工作的效率。所有试验条件基本能满足课题的完成。3 学术与技术水平本组成员201

11、4年就读遵义医学院，本科学历，目前为在校生。五、 经费预算支 出 科 目金 额 （万元）计 算 根 据 及 理 由比例科研业务费实验菌种使用费0.275%测试费用0.2劳务费0.2论文发表费0.2其它业务0.2科技处管理费用实验材料费0.3小型仪器设置费用小型仪器购买0.110%试剂购买费用0.30国内外交流与协作0.410%其 它0.4作为资金储备，以备不时之需5%合 计 4.0万元备注：参考文献 1Jain R K, Forbes N S. Can engineered bacteria help control cancer?J. Proc Natl Acad Sci U S A, 20

12、01,98(26):14748-14750. 2吴克复. 肿瘤微环境与细胞生态学导论M. 北京: 科学出版社, 2009. 215-227. 3牛海玲, 黄荣萍, 宋国勇. 厌氧菌在实体瘤治疗中的应用J. 现代预防医学, 2015,42(23):4414-4416. 4Shintani Y, Sawada Y, Inagaki T, et al. Intravesical instillation therapy with bacillus Calmette-Guerin for superficial bladder cancer: study of the mechanism of bac

13、illus Calmette-Guerin immunotherapyJ. Int J Urol, 2007,14(2):140-146. 5殷卓敏, 吴敬波. 工程厌氧菌靶向肿瘤基因治疗新策略J. 国际肿瘤学杂志, 2006,33(3):189-191. 6王颖颖. 厌氧菌在实体肿瘤治疗中的应用J. 国际肿瘤学杂志, 2010,37(4):278-281. 7Taniguchi S, Fujimori M, Sasaki T, et al. Targeting solid tumors with non-pathogenic obligate anaerobic bacteriaJ. Can

14、cer Sci, 2010,101(9):1925-1932. 8王燕, 赵蔚明. 利用厌氧菌突破肿瘤放化疗抵抗的研究进展J. 国外医学（肿瘤学分册）, 2004,31(11):835-838. 9王琳, 浦寅飞, 王衣祥, 等. 双歧杆菌在肿瘤靶向性基因治疗中的应用J. 国际口腔医学杂志, 2013(2):268-272.10Kizaka-Kondoh S, Inoue M, Harada H, et al. Tumor hypoxia: a target for selective cancer therapyJ. Cancer Sci, 2003,94(12):1021-1028.11B

15、arbe S, Van Mellaert L, Anne J. The use of clostridial spores for cancer treatmentJ. J Appl Microbiol, 2006,101(3):571-578.12张学彬, 王建华. 利用低氧的厌氧菌抗肿瘤治疗J. 中国癌症杂志, 2007,17(11):903-906.13骆鹏, 张庶民. 厌氧菌靶向治疗肿瘤的研究进展J. 中国生物制品学杂志, 2008(10):917-920.14Al-Ramadi B K, Fernandez-Cabezudo M J, El-Hasasna H, et al. Att

16、enuated bacteria as effectors in cancer immunotherapyJ. Ann N Y Acad Sci, 2008,1138:351-357.15黄筱钧, 邓昭敏, 张硕, 等. 厌氧菌在肿瘤生物治疗中的研究进展J. 中国老年学杂志, 2014(22):6507-6509.16Low K B, Ittensohn M, Luo X, et al. Construction of VNP20009: a novel, genetically stable antibiotic-sensitive strain of tumor-targeting Salmonella for parenteral administration in humansJ. Methods Mol Med, 2004,90:47-60.17Theys J, Barbe S, Landuyt W, et al. Tumor-specific gene delivery using genetically engineered bacteriaJ. Curr Gene Ther, 2003,3(3):207-