天然药物化学. 第二章天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术

1、.,第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法和技术,.,第一节 提取方法与技术,天然药物化学的研究是从有效成分或生理活性化合物的提取、分离工作开始的。 在进行提取之前，应对所用的药材进行如下的考查：基源（学名）、产地、药用部位、采集时间与方法。还要系统查阅文献，以充分了解和利用前人的经验。 （同一品种其含成分含量因产地、取材部位、采集时间、存放条件不同而有变化）,.,已知成分或已知化学结构类型：一般先查阅有关资料,（工业生产中常用） 搜集比较各种提取方法 为制定研究工作方案提 供依据。,未知有效成分或有效部位：根据预先确定的目标。 （实验室常用） 以适当的活性测试体 系为指导。 提取、分离

2、、动物模型 筛选。 临床验证。,提取,.,中草药有效成分的提取,提取是研究天然产物的一个重要步骤，常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法和升华法。,水蒸气蒸馏法：适用于有挥发性的能随水蒸气蒸馏而不被破坏且难溶或不溶于水的成分的提取。例如挥发油类成分。 升华法：适用于具有升华性质的成分的提取。例如樟脑、咖啡因等 溶剂提取法:选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。,.,1. 概念：根据天然药物中各种化学成分的溶解性能，选择对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当方法将所需化学成分尽可能完全从药材组织中溶解提出的方法。 溶剂的提取过程是溶剂对药材组织细胞不断作往返的扩散、渗透、

3、溶解的过程，直至药材组织细胞内外溶液中被溶解的化学成分的浓度达平衡为止。,一、溶剂提取法,.,2. 溶剂提取法的提取原理：根据化合物在极性相似的溶剂中有较好的溶解性即“相似者相溶”这一原理进行的。,极性从低到高的顺序依次是： 石油醚二硫化碳苯无水乙醚三氯甲烷乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇乙腈水吡啶,3. 溶剂的极性,与介电常数有关，介电常数越大，极性越大,.,化合物极性大小与分子结构直接相关，一般来说两种基本母核相同的成分，其分子中官能团的极性越大或极性基团数目越多，则整个分子的极性就越大表现亲水性越强，分子的非极性部分越大或碳链越长则极性越小，亲脂性越强。,化合物的极性,.,天然产物的极性大体可

4、分为三类： 极性（亲水性）、非极性（亲脂性）、中等极性（即亲水又亲脂）。 亲脂性成分：萜类、甾体、脂环、芳香族成分，可选用氯仿、乙醚、石油醚等非极性溶剂。 亲水性成分：糖苷、氨基酸等，可选用水、含水醇等极性溶剂。 酸性、碱性及两性化合物：根据存在状态（游离型或解离型）。可选用不同ph值的溶剂。,.,选择溶剂的原则：选择适当的溶剂是提取步骤的关键。主要根据溶剂的极性、被分离成分的性质、共存的其它成分（杂质）的性质三个方面。,对于提取溶剂的要求：对所提取成分的溶解度大，对杂质的溶解度小，或反之；溶剂不能与所提取成分发生化学反应，若反应应当可逆；要经济易得，具有一定的安全性；沸点适中、便于回收和反复

5、使用。,.,水 亲水性成分。有时为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。 如：多数游离的生物碱是亲脂性化合物，不溶或难溶于水，但与酸结合成盐后，能够离子化，加强了极性，变为亲水性的物质，所以通常用酸水提取生物碱；对于有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分，常采用碱水提取，可使成分易于溶出。,.,用水作溶剂提取存在一些问题： 易酶解苷类成分，且易霉坏变质； 对于含果胶、黏液质类成分较多的中草药，其水提取液常呈胶状，很难过滤；含淀粉多的中草药，沸水煎煮时，淀粉可被糊化，过滤困难，所以不宜磨成细粉水煎；含皂苷成分较多的中草药，水提液在减压浓缩时，常会产生大量泡沫，浓缩困难。,

6、.,亲水性的有机溶剂 能与水混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等。乙醇虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，且乙醇的提取液不易发霉变质。因此乙醇是实验室和工业生产中应用范围最广的一种溶剂。甲醇的性质虽和乙醇相似，但因为有毒性，所以少用。,.,亲脂性的有机溶剂 与水不能互溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质，易提取亲脂性的物质。,.,这类溶剂易挥发，多易燃（氯仿除外），一般有毒，价格较贵，设备要求也较高，操作需要有通风设备；透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。药材中水分的存在，会降低这类溶剂

7、的穿透力，很难浸出其有效成分，影响提取率，因此对原料的干燥程度要求较高。 因此，在大量提取或工业生产时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。,.,4. 提取前的预处理： 通常粉碎成粗粉； 种子类先脱脂； 水溶性成分的提取宜将药材切成小段、薄片或粗粉； 苷类要防止酶水解； 苷元及次生苷要保留酶的活性等等。,.,5.影响提取因素：,（1）药材的粉碎度 药材粉碎得越细，中药粉末的表面积越大，提取效率高，但粉碎过细，则表面吸附作用也增强，反而影响扩散速度，降低了提取效率，另一方面，杂质的提取量也增高 。一般情况下，用有机溶剂提取时，以过20目筛为宜。用水提取时，则用粗粉或薄片。,溶剂提取法的关键是选择合适

8、的溶剂和提取方法，但在操作过程中，还受其他因素的影响。,.,（2）温度 一般来讲，热提取效率高，但杂质多，冷提杂质少，效率低。加热温度不宜超过100。在5060的条件下进行提取保持较好的提取率，又不使过多的杂质溶出。,（3）时间和提取次数 药材中有效成分随着提取时间的延长而出量增大，直到药材细胞内外有效成分浓度达到平衡为止。一般情况下，用水加热煮时以每次12小时为宜，进行23次。,.,6.提取方法 常用的提取法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法。 (1)浸渍法 此法适用于有效成分遇热易挥发和易破坏的中草药的提取。按溶剂的温度分为热浸、温浸、冷浸等。,.,操作：现将中草药粉或碎

9、片装入适当的容器中，然后加入适宜的溶剂，浸渍药材以溶出其中有效成分。 特点：简单易行，但提出率较低。最好采用二次、三次浸渍，以减少损失，提高提取率。如果溶剂为水的话，需加入适当的防腐剂。,.,(2)渗漉法 操作：将中草药粉末装在渗漉器中使药材浸渍2448小时膨胀，然后不断添加新溶剂，使其自上而下渗过药粉，从渗漉筒下端出口流出、收集浸出液。 当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效率较高，当浸出液很浅时提取基本完全。但溶剂消耗量大、费时长。,.,渗漉装置,.,(3)煎煮法 操作：将中药粗粉加水加热（加热时最好时常搅

10、拌，以免局部药材受热容易焦糊）煮沸，将中药成分提取出来。 一般药材易煎2次。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。,.,特点：此法简便，能煎出大部分有效成分，但煎出液中杂质较多，且容易发生霉变，一些不耐热挥发性成分易损失。 因此含挥发性成分及有效成分遇热易破坏的中药不宜用此法，对含有多糖类中药，煎煮后，药液比较粘稠，过滤比较困难。,.,(4)回流提取法 如用易挥发的有机溶剂加热提取中药成分时，则需采用回流提取法以减少溶剂消耗，提高浸出效率。但受热易破坏的成分不宜用此法，且溶剂消耗量仍大，操作亦麻烦。 此法提取效率较冷浸法高，但是由于操作的局限性，大量生产中多采用连

11、续提取法。,.,（5）连续提取法： 为了弥补回流提取法中需要溶剂量大、操作较烦的不足，可采用连续提取法。实验室常用索氏提取器。此法需要溶剂量较少，提取成分也比较完全，但一般需数小时（提取液受热时间长）才能完成，因此对热不稳定易变化的成分不宜用此法。 尽管如此，在应用挥发性有机溶剂提取时，不论小型实验或大型生产均以连续提取法为好。,.,索氏提取器,.,(6)超声提取技术,利用超声波的空化作用，破坏植物药材的细胞，使溶剂易于渗入细胞内，同时超声波的强烈震动能传递巨大能量给浸提的药材和溶剂，使他们做高速运动，加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，加速有效成分的浸出，极大地提高提取效率。 超声波在传递过程

12、中形成许多小空穴，这些小空穴瞬间闭合，可形成几千个大气压的压力，同时局部温度可达到千度以上，这种现象叫做空化,.,无需高温。适用于热不稳定。 常压提取，安全性好，操作简单易行，维护保养方便。 提取效率高。 适用性广，绝大多数的中药材各类成份均可超声提取。 提取工艺成本低，综合经济效益显著。,特点,操作,将药材粉末置适宜容器内，加入定量溶剂，密闭后置于超声波提取器，选择适当超声频率提取一段时间。,.,（一）水蒸气蒸馏法：是将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的浸提方法。当馏出液由浑浊变为澄清时，表示蒸馏已基本完成。 该法适用于具有挥发性、难容或不溶

13、于水、与水不会发生反应、能随水蒸气蒸馏而不被破坏的中草药成分的提取。如，麻黄碱就可以用此法直接从麻黄中蒸馏出来，这个方法主要用于挥发油,二、其他提取方法,.,.,(二)升华法 有些固体物质受热后会直接汽化，遇冷后又凝固为原来的固体化合物，该现象称之为升华。对于具有升华性质的有效成分，可采用升华法提取。 如从樟木中提取樟脑，从茶叶中提取咖啡碱。 此法简单易行，但在实际提取时很少采用。因为升华所需温度很高，中草药容易炭化，炭化后产生的挥发性的焦油状物，容易黏附在升华物上，不易精制除去；其次，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。,.,.,超临界流体：一物质处于临界温度（tc）与临界压力（pc）

14、以上的状态下，形成的既非液体又非气体的单一相态时，称为超临界流体。,特点：流体密度近似液体，粘度于气体相似，扩散力比液体大，介电常数随压力增大而增加，渗透性优于液体。比液体溶剂有更佳的溶解力，有利于溶质的萃取。,（三）超临界流体萃取技术,.,二氧化碳的优点： 1）不残留有机溶剂、萃取速度快、收率高，安全不易 燃烧及化学性质稳定。 2）萃取温度较低，适用于对热不稳定物质的提取。 3）萃取介质的溶解特性容易改变，一定温度下改变压力。 4）可以加入夹带剂，改变介质极性。 5）适于对极性较大和分子量较大物质的萃取。 6）萃取介质可循环利用，无毒，成本低。,常用作超临界流体的物质：二氧化碳、氧化亚氮、乙

15、烷、乙烯和甲苯等,.,超临界萃取的局限性： 1）对脂溶性成分溶解能力强，对水溶性成分 溶解能力弱。 2）设备造价高，设备折旧费比例大。 3）更换产品时清洗设备较困难。,.,提取天然药物得到的提取液是混合物，需要进行进一步的分离与精制。去其糟粕，取其精华。,1. 溶解度的差异：如结晶法、沉淀法等 2. 分配比不同：如萃取法 3. 吸附性差异：物理吸附、化学吸附及半化学吸附 4.分子大小差异：透析法、凝胶滤过法、超滤法 5.离解程度不同：离子交换法或电泳,分离依据：共存成分的性质差异,第二节 分离精制和鉴定的方法与技术,.,1.系统溶剂提取法：是研究天然药物成分的初步提取分离方法。用极性从低到高的

16、溶剂依次提取。 石油醚油脂、蜡、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类 氯仿或醋酸乙酯游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素的苷元 丙酮或乙醇、甲醇苷类、生物碱盐、鞣质等 水氨基酸、糖类、无机盐等 本法的缺点：由于各成分之间的助溶作用，同一类成分往往也会分散在邻近的几个部位中。但系统溶剂法仍是研究成分不明的天然药物最常用的方法。,一、根据物质溶解度的差异进行分离,.,2.结晶与重结晶法,结晶和重结晶是利用固体混合物中各种成分在溶剂中的溶解度的差别，使所需成分以结晶状态析出，达到分离精制的目的。 结晶溶剂的选择：（1）不与结晶物质发生化学反应；（2）对结晶物质的溶解度随温度不同有显著差异，热时溶解度大，冷时

17、溶解度小；对可能存在的杂质溶解度非常大或非常小；（3）沸点适中，不宜过高或过低。常用溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等。还可用两种或两种以上的混合溶剂,.,操作：在将被提取物晶体置于单口瓶中，加入较需要量稍少的适宜溶剂，加热到微微沸腾一段时间后，若未完全溶解，可再添加溶剂，每次加溶剂后需再加热使溶液沸腾，直至被提取物晶体完全溶解（但应注意，在补加溶剂后，发现未溶解固体不减少，应考虑是不溶性杂质，此时就不要再补加溶剂，以免溶剂过量）。,.,温度不同溶解度差异 结晶、重结晶,.,3. 沉淀法：在溶液中加入某些试剂或溶剂，使部 分物质沉淀析出，达到分离的目的。,解离型/离子态,h+,b

18、h+,b,oh-,h+,a-,ha,oh-,脂溶性,水溶性,（1）酸碱沉淀法 通过加入酸、碱以调节溶液ph值改变分子的存在状态，从而改变溶解度而达到分离的目的。,.,a酸/碱法（酸提取碱沉淀法） 生物碱的提取、纯化,.,b碱/酸法（碱提取酸沉淀法） 黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化,.,（2）试剂沉淀法 利用成分能与某些试剂产生沉淀，或利用某些成分在不同溶剂中溶解度的差异，通过加入特定试剂或溶剂使生成沉淀，达到分离的目的。 例如：酸性化合物与钙、钡、铅等生成水不溶性盐产生沉淀。 生物碱与苦味酸、磷钼酸等生物碱沉淀剂形成水不溶性盐沉淀；雷氏铵盐与季铵碱生成生物碱雷氏铵盐沉淀；胆固醇与甾体皂苷生成

19、沉淀；蛋白质与鞣质形成沉淀等,.,a.水/醇法除去多糖、蛋白质、淀粉、无机盐等水溶性杂质。 b.醇/水法除去脂溶性的油脂、树脂、叶绿素等水不溶性杂质。 c.醇/乙醚（丙酮）法因皂苷类在醇中溶解度大，而在乙醚中溶解度小沉淀析出。,.,a 水/醇法除去水提液中的水溶性杂质,.,b 醇/水法：除去醇提液中的脂溶性杂质,.,c 醇/醚法（醇/丙酮法）：纯化皂苷,.,二、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,常见的有简单的液-液萃取法、逆流分溶法（ccd）、液滴逆流色谱（dccc）、高速逆流色谱（hsccc）、液液分配色谱（lc/llc）、纸色谱（pc）等。,.,1. 液-液萃取与分配系数k值 原理

20、：利用混合物中各成分在两种互不相溶溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。 根据分配定律，化合物在一定的温度和压力下，溶解在两个同时存在的互不相溶的溶剂里，达到平衡后，该化合物在两相中浓度的比是一个常数，称为分配系数k值。,k=cu/cl,cu表示溶质在上相溶剂中的浓度；cl表示溶质在下相溶剂中的浓度,（一）两相溶剂萃取法,提取液中加入一种与其互不相溶的溶剂配成两相溶剂系统，利用混合物中各种成分分配系数的差异进行分离,.,各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率就越高。k=cu/cl,举例：a、b两种溶质在chcl3/h2o中进行分配，如a、b均为1克，ka=10，kb=0.1，两相溶剂体

21、积比为v chcl3/vh2o=1，在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，90%以上的溶质a将分配在上相溶剂（水）中，不到10%的a分配到下相溶剂（氯仿）中。同样的道理，溶质b分配将与a相反。,.,定义：分离因子可定义为a、b 两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。如上例，则其分离因子=ka/kb，即ka=10；kb=0.1； =ka/kb=10/0.1=100 一般，100时，仅作一次简单萃取就可实现基本分离；但10010时,则须萃取10-12次；2时，要想实现基本分离，须作100次以上的萃取才可以。1时，则kakb。意味着两者性质极其相近，用分配无法实现分离。,2. 分离难易与分离因子,.,

22、3.逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。 利用两种互不相溶的溶剂相对密度的不同，使相对密度小的相液作为流动相，逆流连续穿过相对密度大的作为固定相的相液，借以交换溶质而达到分离的目的。 优点：操作简便，萃取较完全，避免乳化。,.,4. 逆流分溶法（ccd） 此法相当于多次萃取。,在no.0漏斗中溶入溶质并加入流动相。振摇使两相溶剂充分混合，静置分层后，分出流动相，令其移入no.1管，再在no.0管中补加新鲜流动相，再次振摇混合，静置分层并进行转移。如此连续不断地操作下去，溶质即在两相溶剂中，不断地重新分配并达到分离的目的。,.,流动相液滴垂直上下，经

23、过固定相液,5. 液滴逆流色谱（dccc）,.,6. 纸色谱法 以滤纸为支持剂，滤纸上吸着的水为固定相，用一定的溶剂系统为移动相进行展开，利用混合物中各成分分配系数的差异达到分离的目的。纸色谱的原理与液-液萃取基本相同。,操作技术 点样：点样量一般为几毫克至几十毫克，点样量大则点样原点宜大些。 展开：上行法或圆形法 显色：先在日光或紫外灯下观察有无颜色或荧光，再喷洒相应的显色剂。 计算比移值（rf）：原点至色谱斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离,.,7. 液-液分配柱色谱,固定相涂覆于硅胶等多孔载体上，装柱 流动相通过色谱柱进行洗脱 物质在两相溶剂中作逆流分布 分配系数不同，被洗脱速度不同,

24、原理：,.,.,载体：有硅胶、硅藻上、纤维素粉 正相色谱：固定相：水、缓冲液 流动相：氯仿、乙酸乙酯、丁醇 适合分离水溶性或中等极性的成分：生物碱类、苷类、糖、有机酸。用流动相洗脱时，极性小的成分先被洗脱。 反相色谱：固定相：石油醚、异三十烷、石蜡油 流动相：水、甲醇 适合分离脂溶性化合物：高级脂肪酸、油脂、游离甾体。当用流动相洗脱时，极性大的成分先被洗下来。,.,加压液相柱色谱 为了提高分液速度，缩短分离时间，在加压条件下进行分离，加压液相色谱用的载体多为颗粒直径很小，机械强度与比表面积比一般色谱用的硅胶大的球形微粒，按所加的压力不同可分为： 快速色谱（flc）2个气压，分离范围10mg-g

25、 低压液相色谱(lplc)20个气压，分析型:分离范围 ug-10mg 制备型: 分离范围mg-g,.,.,分馏法：利用各沸点不同的化合物，在分馏过程中产生高低不同的蒸气压，从而收集到不同沸点温度的馏分达到分离的目的。,三、根据物质沸点不同进行分离,.,四、根据物质的吸附性差别进行分离,原理：利用混合物中各成分对吸附剂的吸附能力不同而达到分离，其中固-液吸附用得最多，分为物理吸附，化学吸附及半化学吸附。,物理吸附： 分子间力，无选择性，可逆。 硅胶、氧化铝、活性炭 化学吸附：化学键，选择性较强，常不可逆。 硅胶生物碱 碱性氧化铝黄酮、蒽醌等 半化学吸附：氢键，选择性较弱，多可逆 聚酰胺,.,1

26、. 物理吸附的基本规律相似者易于吸附 吸附过程中的三大要素：吸附剂、溶质、溶剂,.,常用吸附剂 氧化铝、硅胶、硅藻土、氧化镁、碳酸钙、活性炭等。 （1）硅胶：为一多孔性物质，可用通式sio2h2o表 示。它具有多孔性的硅氧环， siosi的交键结构，由于其骨架表面具有很多游离、键合和键合活性状态的硅醇基。它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量的水分。,.,硅胶含水量与活性的关系 活 性 加入水量（%） i 0 ii 5 iii 15 iv 25 v 38,活化：100-110oc 30min,.,（2） 氧化铝：是一种吸附力很强的亲水性吸附剂，有酸性、碱性和中性三种规格。其吸

27、附活性也与含水量有关 氧化铝含水量与活性的比较 活 性 加入水量（%） 0 3 6 10 15,.,活性炭吸附法 结晶、重结晶中脱色、脱臭 从大量稀水液中浓缩微量物质,（3）活性炭 简单吸附法用于物质的浓缩与精制,.,（4） 吸附柱色谱用于物质的分离 在实际工作中硅胶与氧化铝柱色谱用的最多。,.,吸附剂与样品量的比例：3060：1 极性小，难以分离的样品：100200：1 色谱柱长度与内径比例： 1520 ： 1 吸附剂的粒度：100目，难以分离的样品可采用200300目。粒度太细，谱带容易扩散，可采用加压色谱。,操作时需要注意的问题,.,样品与吸附剂的装柱 吸附剂选用极性小的溶剂装柱，样品同

28、样以湿法装柱。如果样品在极性小的溶剂中溶解度小，则改用极性大的溶剂溶解后，再用不到装柱量1/20的吸附剂拌匀，于60下加热挥散溶剂，研细后再小心铺在吸附剂柱上。,洗脱用溶剂的极性应逐步增加 往往采用梯度洗脱，实践中多用混合溶剂，一般混合溶剂中强极性溶剂的影响比较大。不可随意将极性差别很大的两种溶剂混合使用。对于极性较大的成分常用氯仿-甲醇，按不同比例梯度洗脱，对比较容易洗脱的极性小的成分，可用氯仿-乙醚或氯仿-乙酸乙酯。,.,为避免发生化学吸附：酸性物质的分离选用硅胶、碱性物质的分离则选用氧化铝为好。 碱性物质用硅胶分离时：在洗脱溶剂中加入碱性物质（氨、吡啶、二乙胺等）； 酸性物质用氧化铝分离

29、时：洗脱剂中加入醋酸等。 通过tlc进行筛选溶剂系统：在tlc展开时使组分rf值达到0.2-0.3的溶剂系统，为柱色谱的最佳洗脱溶剂系统。,.,薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板（一般是玻璃板）上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。 如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析； 如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析； 如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析； 薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析,薄层层析,.,薄层板的制作 支持板要表面平整、光滑，用

30、前应洗净、干燥。 常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉等)，调成糊状物所制成的薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板。硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可直立展开，而软板只能近水平展开。,.,层析方法 点样 距底边1-1.5cm处，用毛细管点样，直径不超过2-3mm 展开 展式方式与纸层析一样，有上行法、下行法等，但软板薄层只能近水平展开（与水平成10o-20o）。 吸附薄层层析所用展开剂主要是低沸点的有机溶剂，一般采用2-3种组分的多元溶剂系统。展开剂的选择是根据被分离物极性、溶剂的极性以及支持剂的特性三方面来考虑。,显色

31、：可先在日光下观察，标出色斑并确定位置，然后在紫外灯下观察和标记，必要时在选择显色剂显色观察。,.,定性与定量分析 薄层层析法用rf值来表示被分离物质在薄层上的位置，与已知标准物质 的rf对照，可进行定性分析。,定量分析时，可把斑点所在位置的支持剂连同物质一起刮下，然后用适当溶液将其从支持剂上溶解下来，再测定其含量。用目测法比较样品斑点和对照品斑点的颜色深度和面积大小，或测量斑点的面积，可以进行半定量分析和限度检查，有条件时，可用薄层扫描仪进行定量分析。,.,a,b,chcl3：meoh(7:3) chcl3：meoh(3:7),吸附剂：硅胶,.,2. 半化学吸附-聚酰胺色谱,聚酰胺吸附色谱属

32、于氢键吸附。对于极性物质和非极性物质都适用，主要适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。,聚酰胺的性质,1.高分子聚合物 2.不溶于水和常用的甲醇、乙醇、乙醚及丙酮等有机溶剂 3.对碱稳定 4.对酸特别是无机酸稳定性差 5.可溶于浓盐酸、冰乙酸、甲酸,.,聚酰胺吸附原理:氢键-半化学吸附,由于分子中含有酰胺羰基及游离胺基，在水溶液中能与含有酚羟基以及羰基的化合物通过氢键结合而被吸附，从而与不含上述基团的化合物分离。,.,吸附规律 ：（含水溶剂中） 形成氢键的基团数目越多，吸附能力越强 易形成分子内氢键者，吸附相应的减弱 分子中芳香化程度高，吸附作用增强,.,各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力 水 甲醇

33、乙醇 氢氧化钠水溶液 甲酰胺 二甲基甲酰胺 尿素水溶液,化合物在不同溶剂中的吸附力，随溶剂极性增强而增强 水中最强常以水装柱、样品以水溶解上样 含水醇中次之 醇中最弱常以浓度渐高的含水醇梯度洗脱 etoh-h2o最常用,弱,强,吸附规律 ：（含水溶剂中）,.,操作：用水装柱,样品也尽可能的做成水溶液,使其充分被吸附,先用水洗,逐步提高醇的浓度。各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力为：水甲醇（乙醇）丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,聚酰胺色谱的应用：,醌类、黄酮类等酚性的制备和分离。 脱鞣处理 生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等极性与非极性化合物的分离也有用途,.,五、根据物质分子大小差

34、别进行分离,天然有机物的分子大小不同，表现出不同的分子量，故可以根据分子量的大小进行分离。常用的方法有： 透析法:利用半透膜的膜孔(透析袋、膀胱墨、火棉胶) 凝胶滤过法：利用凝胶的三维网状结构。 超滤法：利用分子大小不同引起的扩散速度的差别。 超速离心法：利用溶质在超速离心引起的作用下具有不同的沉降性或浮游性。 以上方法主要用于水溶性大分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖类的脱盐精制及分离工作。,.,1.透析法： 透析法是利用小分子及小离子在溶液中可通过半透膜而大分子及大离子不能通过的性质，借以达到分离。如分离纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等成分时，即可用透析法除去小分子杂质如无机盐、单糖、双糖等。

35、,.,2. 凝胶滤过法（gel filtration） 原理：是利用分子筛分离物质的方法。所用载体葡聚糖凝胶在水中不溶解，但遇水后膨胀成具有三维空间结构的球形颗粒。由于凝胶网孔半径的限制，大分子物质不能渗入凝胶颗粒内部，故只在颗粒间隙移动，并随溶剂一起先从柱底流出，小分子因能自由地渗入到凝胶内部，通过色谱柱时阻力增大，流速变慢，后流出。样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入凝胶颗粒内部的程度不一样，按分子由大到小的顺序先后流出得以分离。,.,凝胶三维网状结构的分子筛作用 按分子量由大到小的顺序分离,.,凝胶的种类与性质,常用的有葡聚糖凝胶（sephadex-g）和羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex-lh-20)。 (1) sephadex-g 由平均分子量一定的葡聚糖与交联剂（如环氧氯丙烷）交联聚合而成，生成的凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量及反应条件。加入的交联剂数量越多，网孔越紧密，孔径越小，交联度越高，吸水膨胀也越小，反之，交联度越低，网孔越稀疏，吸水后膨胀也越大。商品型号按交联度大小分类，并以