酶工程课件.ppt

1、第一章 绪论,一、应用举例： 1、纤维素酶：酒精燃料，纺织品抛光和剥色，废纸脱墨。 2、蛋白酶：皮革软化，助消化剂，洗涤剂。 3、青霉素酰化酶：各种新型一内酰胺抗生素。,二、酶和酶工程极其主要内容：1、酶：是一种生物催化剂，即：具有催化作用的蛋白质或RNA。2、酶工程：酶的研究、生产和应用的技术。3、酶工程的主要内容：,优良产酶菌种的育种； 酶的分离纯化； 酶的分子修饰； 酶反应器； 酶的应用；,酶的发酵生产 酶反应动力学 酶与细胞固定化 酶传感器,三、酶工程发展概况,1、早期不知觉的利用阶段：酿酒，制饴。 2、认识酶的阶段： Pasteur:酵母中存在一种将葡萄糖转化为酒精的物质。 Bchn

2、er:酶在胞外也具有催化活性。 Sumner:分离脲酶结晶。 Michaelis:提出米氏方程。Koshland“诱导契合”理论 3、从生物组织或细胞中提取酶： 胰酶：皮革软化； 木瓜蛋白酶：啤酒澄清 4、酶的发酵生产： 日本人首先用液体深层发酵法生产-淀粉酶。,5、酶固定化： 日本人首先用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基酸； 日本人首先用海藻酸钙凝胶包埋酵母细胞生产啤酒； 6、发展趋势： *基因工程改造和表达酶 *酶法在化学合成中的应用 *开发新酶及其新用途 *酶的固定化,四、酶学基本概念,全酶 酶的活性中心 酶的别构调节作用 多酶体系 同工酶 酶原 诱导酶,五、酶学的一些新概念,1.酶的活性

3、中心:酶蛋白分子中一些基因在空间上相对集中形成一个直接参与底物识别结合和催化底物转变为产物的区域。 2.酶的别构调节:作用这种酶一般有多个亚基,除了活性中心外，还有可和别构调节物结合的别构部位,这两个部位可在不同的亚基上或在同一亚基的不同部位中，当调节物和别构部位结合后可引起酶的构象变化，导致活性中心对底物的结合和催化活性的改变，从而调节酶的活性. 3.全酶:含有辅助因子的酶,当酶辅助因子结合在一起时称为全酶. 4.寡聚酶:由多个相同或不相同的亚基组成的酶 5.多酶体系:由几种酶彼此以非共价键结合在一起形成的复合体,这些酶各催化不同的反应,它们组合起来催化一系列反应的连续进行。例如:脂肪酶合成

4、酶复合体.,6.诱导酶:当细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶,它的含量在诱导物存在时显著提高。诱导物常是其底物或其类似物.例如:大肠肝菌的半乳糖苷酶(乳糖为诱导物).相对地,把细胞中含量较稳定，受外界影响较小的酶称为结构酶. 7.核酶(Ribozyme):具有催化活性的RNA.由Cech于1981年首次发现.1)四膜虫rRNA的自我剪切作用(self-splicing),2)RNase P 中的RNA具有使tRNA5一端成熟的作用,3)13srRNA具有肽基转移酶(Peptidy1 transferase)的作用.,8.模拟酶:在基本骨架上连接酶活性中心的化学基因而形成的,这些基因可以结合底物

5、并能催化底物转变为产物.例如: 1)胰凝乳蛋白酶的模拟酶：将Asp的羧基， His的味唑基和 Ser的羧基连接到环糊精上，发现其具有催化芳香酰类化合物的水解，但能耐和pH )谷胱甘肽过氧化物(GSHPx)的模拟酶: Glu-SelCys-Gly三肽也具有 GSHPx的活性,即催化 GSSG (还原型)+H2O2 H2O+ GSSG(氧化型谷胱甘肽).Se(硒)和 Cys相结合而形成 SelCys.,9.改造酶:主要是指利用蛋白质工程的方法改变酶的一级结构,从而使其功能或特性发生改变。例如： 1)将枯草杆菌蛋白酶的Gly166Lys166 后，水解谷氨酸相邻肽键的效率较原来的酶高500倍 2)葡

6、萄球菌核酸酶:该酶水解RNA或 DNA单链,但专一性很低.如果在其 Cys116上接上 22bp的 oligonucleotide,这时该酶只能水解与该寡核苷酸序列互补的序列的相邻核苷酸序列,从而提高了其专一性. (Gly-Phe) Gly-Phe,10.抗体酶:用底物过渡态类似物作为半抗原免疫动物，从而制备其抗体。这样得到的抗体理论上应能与底物结合并能发挥催化作用。例如:用三乙烯酰胺衍生物化学修饰的肽复合物(Gly-Phe)作为半抗原制备出能水解 Gly-Phe肽键的抗体酶.该方法为今后获得水解任何肽键的抗体酶奠定了基础,这对蛋白质一级结构的测定具有重要意义.,第二章 酶的发酵生产,一、有关

7、说明：本章内容在发酵工程中详细介绍。 二、从动植物组织中提取酶： 1、一些酶难以从微生物获得或表达：胰酶，木瓜蛋白酶。 2、缺点：工艺复杂、成本高、劳动强度大、难以大规模生产、酶的品质难以优化。 3、优点：投资小，技术条件要求低。,三、微生物发酵产酶,1、产酶细胞的条件：产酶量高，培养基廉价，产酶性能稳定不易退化，不易受噬菌体侵袭，酶易于分离纯化（胞外酶），容易培养和管理，安全无害。 2、发酵产酶的方法：固体培养发酵，液体深层发酵，固定化细胞发酵。 3、提高酶产量的措施：添加诱导物（底物或其类似物：青霉素可诱导青霉素酰化酶，IPTG可以诱导-半乳糖苷酶），控制阻遏物浓度葡萄糖阻遏-半乳糖苷酶，

8、组氨酸合成酶，添加表面活性剂（吐温），添加产酶促进剂。 4、优点：胞外酶易于分离纯化，可以大规模地生产酶，可以用遗传学方法或基因工程方法改造酶，成本一般较低。 5、缺点：投资大，技术条件要求高。 6、发展方向：基因工程改造、克隆和表达产酶。,四、举例：5磷酸二酯酶的发酵生产：,1、液体深层发酵流程： 斜面培养：用8%麦芽汁琼脂培养基，30 培养三天。 种子培养：同上，接种于茄子瓶 发酵培养：培养基组成为5%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.05%K2HPO4、0.04%MgSO47H2O、0.04%CaCl22HO、0.02%ZnSO4 7H2O,调pH6.0 28 30 通风培养。当酶活力分泌达到

9、最大值时，即可停止发酵。下游提取：放罐，滤去菌体，即得粗酶液，10以下保存备用。,2、固体培养的流程：,斜面培养：将保存的桔青霉在察氏培养基上活化，28 72小时左右成灰绿色孢子。接入克氏瓶培养。 种子培养：麸皮100克和水150毫升搅匀，装入容积为2升克氏瓶中，消毒，接种后28 培养，72小时左右长成灰绿色孢子。 曲盘培养：一个克氏瓶接45个曲盘，接种量约为5%。每个曲盘（3545平方厘米）内装500克麸皮。麸皮：水=1：1.21.3。曲房温度为2628 ，需保持湿润。约34天后固曲培养到灰绿色时酶活力最强，应立即出曲。如果时间延长，菌变成深绿色时，酶活力下降，培养5天则变成褐绿色至褐色，活

10、力几乎全部消失。 浸取酶液：加35倍水浸取，滤去菌体即得粗酶液。,3、发酵曲线：,不管是液体培养或固体培养，菌体分泌5磷酸二酯酶的规律如图所示。在培养的前期，仅有菌的生长，并无酶的分泌，到菌的生长达直线生长期时，酶的分泌也呈直线增加。当菌的生长到禁止期时，酶的活力不再增加。时间过分延长回因污染杂菌而导致酶活力的下降。采用固曲培养时，此现象尤为明显。,第三章 酶的分离纯化,基本流程： 1、细胞破碎（胞内酶） 2、抽提（extract) （胞内酶） 3、固液分离 4、粗分离（蛋白质的选择性沉淀） 5、纯化 6、浓缩、结晶或干燥 7、产品化,一、细胞破碎,1、机械破碎法： *机械破碎法：设备简单，可

11、大规模生产，但破碎不完全并对酶活有影响。 *研磨法：研钵，球磨机和细菌磨，可大规模生产但效率低。 *匀浆法：不适于大规模生产，效率不高。 2、物理法： *温度差破碎法：温度突然变化使细胞破碎。细胞冻存。 *压力破碎法：设备复杂昂贵。 *超声波破碎法：1025KHZ，产热，处理样品少。,3、化学破碎法：有机溶剂或表面活性剂（Tween,triton),改变膜通透性。有机溶剂易燃易使酶失活，而后者常需用凝胶层拆除去。 4、酶法：溶菌酶作用于细胞壁的-1，4糖苷键。几丁质酶作用于霉菌细胞壁中的几丁质。缺点：价格贵，且不利后续分离纯化。 5、自溶法：在一定pH和温度下，利用自身的酶使细胞裂解。在保温过

12、程中，目的酶会失活，而且会滋生其它微生物。,二、酶的抽提,1、酶的抽提是指在一定条件下，使酶充分溶解到溶剂中的过程。 2、需要考虑的因素： *温度：一般在0 10 *pH：一般远离目的酶的等电点 *抽提液的体积：一般为酶原料的3 5倍体积 *添加保护剂：蛋白酶抑制剂，抗氧化剂或酶的稳定剂 *离子强度：有利于提高酶的溶解度,三、固液分离,1）离心方法：量小，产热，价格贵。离心机的种类：管式离心机，碟片式离心机，卧式沉降离心机等。 2）过滤：压力过滤器、板框式过滤器、布袋过滤。过滤介质有：滤纸、滤布、玻璃纤维、陶瓷滤板等。助滤剂有：硅藻土、活性炭、纸等。,四、酶的粗分离,酶的粗分离就是指酶的选择性

13、沉淀，及：用一定方法把目的酶沉淀出来或把杂蛋白沉淀除去。 1 盐析沉淀法 1）什么是盐溶现象？什么是盐析？ 2）什么是分级盐析法？ 3）为什么硫酸铵是盐析最常用的盐？ 在水中的溶解度大，溶解度受温度影响小，价廉。 4）盐析沉淀法有何优缺点？,2、 有机溶剂,1）有机溶剂具有降低水的介电常数和破坏水化层的作用，从而使酶沉淀。 2）常用有机溶剂：乙醇，丙酮，异丙醇等。 3）优点：分辨率高，所得的酶沉淀易于分离且不含无机盐，易于后处理。 4）缺点：有机溶剂易使酶变性，需低温操作；易燃、易爆、有毒。,3、 等电点,1）原理：在pH为酶的等电点时酶分子所带的净电荷为零，从而易聚集沉淀。 2）缺点：在等电

14、点时酶分子表面的水膜仍然存在，所以酶仍然有一定的溶解度而沉淀不完全。 3）等电点法常用于和其它沉淀法联合使用来沉淀酶和用于从粗酶中除去杂蛋白。,4 复合沉淀法,1）复合沉淀法：某些物质可以和酶形成复合物而沉淀下来，分离沉淀后又可以用适当方法解离出来，从而达到分离酶的目的。 2）常用沉淀剂：单宁、聚丙烯酸。 3）例如：聚丙烯酸在pH3-5时和酶结合沉淀析出，pH6以上则二者分离，用2N H2SO4处理聚丙烯酸可重复使用。 5 选择性热变性,五、纯化,1 分子筛层析 2 离子交换层析 3 亲和层析 4 电泳 5 吸附层析,六、举例:核酸酶的提取和精制,1、粗酶液的制备 若采用液体培养法，发酵液经布

15、袋压滤除去菌体，即得金黄色透明粗酶液，在10 下保存。若采用固体培养法，10倍的40-50的水保温，浸泡和间歇搅拌1小时后，用布袋压滤，即得粗酶液。在5-核苷酸的工业生产上，一般均直接使用粗酶液。,2、酶粉制备,预冷的酶液加入三倍体积预冷的工业酒精，使终浓度达70%以上。酶便呈絮状沉淀大量析出，放置过夜。所有操作温度要求在5 左右。吸去上清液（回收酒精），离心得到酶糊，真空干燥或吹风干燥，得到固体，研磨成粉，即为酶粉。一升发酵液通常可得1-2克酶粉，活力回收在70%以上。酶粉十分稳定，密封后在室温下可保藏一年以上。具有体积小、易保藏的优点。,3、纯酶制剂的制备,对此酶的性质进行研究或欲将此酶用

16、于核酸的结构研究，则需要制备较纯的酶制剂。日本曾将此酶纯化了1，500倍，得到一个超离心和圆盘凝胶电泳均一的纯酶制剂。所有操作均在4 进行。 （1）抽提：20千克固曲用60升自来水浸泡2小时，间歇搅拌，布袋压滤，得到50升粗酶液。 （2）第一次硫酸铵沉淀：加入34千克硫酸铵达0.9饱和度，放置过夜，离心，沉淀溶于1.5升去离子水中，透析过夜。 （3）热处理：在透析好的酶液（2 .3升）中加1MZnCl2溶液上使终浓度为7103 M，用0 .1NNaOH调pH至5.3，在70水浴中搅拌加热至60，再移至63水浴中，在63不断搅拌维持15分钟，用冰浴冷至5，离心除去沉淀得2 .5升酶液。经这步处理

17、可钝化其他不需要的酶，例如水解RNA生成3-核苷酸的核酸酶、非专一的磷酸酯酶和5-核苷酶。,（4）第二次硫酸铵沉淀：加入750克硫酸铵，饱和度为0.4，放置过夜。离心除去沉淀。再加820克硫酸铵使上清液达0.8饱和度，放置过夜。离心收集沉淀，再溶于265毫升去离子水中，透析过夜。 （5）丙酮沉淀：270毫升冷丙酮（-10）加入420毫升透析液中，搅拌30分钟，放置2小时后，在-5离心10分钟，将沉淀，溶于188毫升0.05M醋酸缓冲液（pH 6.0）中，透析。 （6）第一次葡聚糖凝胶G-100过滤：凝胶柱用上述缓冲液平衡后，样品上柱，用同样的缓冲液以20毫升/小时的流速过滤，收集比活力较高的溶

18、液2升，加1，368克硫酸铵达0.9饱和度，放置2小时，离心，沉淀溶于25毫升0.05M醋酸缓冲液（pH 6.0）中，并对缓冲液透析。,（7）第一次DEAE纤维素柱层析：将酶活力峰收集得300毫升，加入205克硫酸铵，0.9为饱和度，放置2小时，离心，沉淀溶于20毫升0.05M醋酸缓冲液（pH 6.0）中，并对缓冲液透析。 （8）第二次DEAE-纤维素柱层析：所得的26毫升浓缩酶液用同样方法在DEAE纤维素柱层析一次，酶集中在一个峰内流出，收集后透析过夜，得12毫升。 （9）第二次葡聚糖凝胶G-100过滤：酶活力集中在一个峰内。收集后对流动蒸馏水透析过夜。透析液放在盛有P2O5的干燥器里在4

19、冷冻干燥。得到纯的酶制剂。超离心检查只有一个峰，电泳也是均一的，等电聚焦结果也是一个蛋白峰，等电点为4.5。,问题：,1、制酶粉时为何用有机溶剂沉淀而不用盐析？ 2、得到酶沉淀后能否停下来室温放置过夜再做（会变性和变坏吗？） 3、鉴定酶是否纯的方法有哪些？ 4、硫酸铵饱和度是指什么？,第六节 酶制剂,一、种类： 状态：液体、固体（粉末、冻干粉、结晶） 二、级别： 医药级：纯 无抗原 食品级：无重金属、细菌含量不超标 工业级： 研究级：,三、各种酶制剂的特点,1、冻干粉、SOD稳定价格贵、医药或保健品 2、粉末：稳定可大量生产，价格低，食品级 3、液体：价格便宜，不稳定，不易运输，工业级 4、结

20、晶：有规则的排列（研究级）。 粉末无定型 40%开始下降，60%过饱和，熵最低到结晶,第七节 酶活力测定,1、酶活力单位（U）：在一定条件下，一般是指最适条件，1分钟内能使1umol底物转化为产物所需的酶量为1U，国际单位IU 2、酶浓度：单位体积内所含的酶活力单位（U/ml） 3、比活力: 单位重量中所含的酶活力单位(U/mg） 4、酶活力的测定条件：1）V= V0 2）S E （a）t达到一定时，p达最大 （b）V0一定（可以认为）V0= V,问 题:,1.判断反应速度的标准是什么? 2.多长时间内为反应速度? 小于5%的底物转化为产物. 设时间梯度测定v并判断v=v的平均值,酶活力测定实

21、例,第五章 酶反应动力学,4. 酶反应动力学 是研究各种酶反应的影响,以及 反应物到产物之间可能进行的历程. 1.当t=0时,p为0,随着t增加, p增加,当t达到一定值时, p达到 最大并不再随t的增加而增加. 2.v=dp /dt,反应刚开始时,初速度 ,然后，v随t的增加不断减小,直到v=0. 3.,E,4.1单底物酶促反应动力学,4.1.1底物浓度对反应速度的影响 酶促反应动力学曲线 随S增加,V增加 当S达到等值, V达到最大值,此时 为零级反应. 当S很小时,为一级反应. S为中等值时,介于一级和零级之间,4.1.2米氏方程,反应刚开始时，P为0，故,1,k,米氏方程反映的是,但无

22、普遍适用性，因为有些酶促反应速度很快，足以破坏米氏假设的平衡态,米氏常数,也是当 时的 单位和S相同,当,4.1.5,1.（双倒数）作图,缺点：不够准确；不利观察E的作用机制,2.Eadie-Hofstee作图,4.2多底物酶促反应动力学,单底物反应只有异物酶;裂合酶可看成是单向单底物反应,水解酶,由于水的浓度可以看作是常数，也可认为是单底物,而其它则是多底物酶促反应 4.2.1多底物酶促反应动力学分类 1.在反应中形成三元多合物 (1)序列有序机制,(2)序列随机机制,2.不形成三元络合物乒乓机制,4.2.3双底物反应恒态动力学,1.Alberty表达式,5.酶的抑制作用,生物体内的酶促反应

23、速度是得到调节，也必须被调节.调节酶的活性有两个方面: 抑制和激活.抑制剂就是指能降低酶催化反应速度的物质。 通过研究酶的抑制作用有二个意义:部分揭示催化机理;研究体内的代谢及其调控.,5.1酶的可逆抑制作用,可逆抑制剂和酶是以可逆反应(外共价)结合，可通过透析,超滤等物理手段使酶活性恢复 竟争性抑制: 抑制剂往往和底物具有相似结构,和底物竞争E上的同一结合部位,和酶结合使得底物不能和酶结合,导致酶无法发挥催化功能，在物不能转受为产物,反应式,5.（双倒数）作图,特点:,底物和抑制往往具有相似结构,可以通过加大S而减小或清除抑制作用. 举例: 并二酸对琥泊酸脱H酶的抑制 磺胺类药物对四氢叶酸合

24、成酶的抑制,5.1.2 反竞争性抑制,1.定义:酶和底物结合,导致构象改变,并显出抑制剂结合的部位,或者结合到ES的S上和ES结合. 2.反应式:,4. 双倒数作图,Vm 和 Km都减小,5.特点: (1)不能通过增加S而消除抑制作用,(2)Vm 和 Km 都随I增加而减小,5.1.2 非竞争性抑制作用,1.定义:I可和E或ES结合,EI或ESI都不能形成P即I和作底物结合部位结合 2.反应式: 3.方程式:,4.双倒数作图,5.3 酶的不可逆抑制作用,5.3.1 非专一性的不可逆抑制作用: 乙酸酐 氨基, 羟基, 酚基 5.3.2 专一性的不可逆抑制作用: 它具有和底物类似的结构,并可以和相

25、应的酶专一性的结合,带有一个活泼的化学作用,和酶的必需基因发生反应,对后者进行化学修饰,从而抑制酶的活性. 亲和标记试剂,例如:,胰凝乳蛋白酶的底物,2,胰凝乳蛋白酶的Ks型抑制剂,第六章 酶与细胞固定化,一、固定化酶：把酶或菌体固定在固体载体上（使反应局限在一定范围）内进行。使酶在一定的空间范围内进行催化反应。 二、固定化细胞或原生质体：将活的细胞或原生质体固定到固相载体上，使其在一定的空间范围进行生命活动，同时产生目的产物。,三、游离酶的优缺点（固定化酶）,1、游离酶对温度、PH等外界因素稳定性差 2、游离酶不能回收重复利用 3、游离酶和产物混在一起给进一步分离纯化分离带来困难 4、难以进

26、行工业自动化 四、固定化酶和固定化细胞有何不同？,第一节 酶和细胞固定化方法,一、吸附法 1、利用非离子键和非共价键将酶或细胞固定到载体上 2、吸附剂：活性炭、羟基磷、灰石、氧化铝 3、优缺点：吸附不牢、易脱落、不硬气引起酶活性改变,二、包埋法：常用于细胞固定化（没有化学键） 1、将酶包埋在多孔载体中 2、常用载体：琼脂糖、聚丙烯酰胺、海藻酸钠 3、特点：条件温和、不易使酶变性、反应物和产物不易进出、反应效率不高 三、结合法 1、离子键结合法：适用于酶 1）离子键使酶和载体结合 2）载体：DEAE-纤维素、CM-纤维素 3）结合不牢固、容易脱落、不引起酶性质改变 2、共价结合法 1）通过化学反

27、应：使E以共价键和载体结合。E-NH-（CL）CH3-纤维素-N3 2）连接方法：叠氮法、烷化法、交联法 E-OHC-C-C-C-CHO-E-NC-C-C-C-CH-E,第二节 固定化酶的性质,影响固定化酶性质的因素：结构发生变化，反应微环境，底物的扩散。 1、稳定性：空间结构被部分定型、对垫、变性型蛋白酶等的稳定性提高 2、最适温度：最适温度和活化能变化不大 3、最适PH：变化大 1）载体 O-E PH）溶液中的PH 2）扩散效应 4、底物特异性：可能会有些改变 1）酶空间构象被改变 2）空间位阻 OES越大，特意性改变越大 5、Km值，一般也会改变,第三节 固定化细胞和原生质体,1、概念

28、2、固定化方法特点 3、应用 1）微生物：酒精、氨基酸、有机酸、色素、辅酶 2）废水处理,第四节 固定化酶的表征,1、活力单位 u/mg（干固体） 2、偶联率=（加入酶活力数上清中酶活力数）/酶活力数 3、半衰期：在连续工作的情况下、固定化酶活力下降为原来最高活力的一半所需的时间,第五节 固定化酶和固定化细胞 的应用,1、亲和分离系统：例如：亲和色谱对于药用重组蛋白的纯化十分有效 2、药物控释载体：在基因治疗中，如用红细胞生成素（EPO）基因治疗贫血，可将表达EPO的工程细胞株包埋于一小囊内植入组织中，达到缓释EPO的效果。 3、生物传感器：如Pharmacia公司BIA系统和目前市售的葡萄糖

29、检测仪，免疫分析检测早孕等 4、工业和环保：固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖浆，固定化细菌处理印染废水,实例：,1、固定化酰化酶制备：18.5克DEAE葡聚糖凝胶A-25（OH型），悬浮于100毫升蒸馏水中，加入1670毫升米曲酰化酶溶液，搅拌5小时后放置过夜，过滤弃去滤液，沉淀与1000毫升蒸馏水搅拌1小时，过滤弃去滤液，如此反复用蒸馏水洗1-2次，依次用1000毫升醋酸钠和1000毫升蒸馏水按上述方法洗一次，过滤弃去滤液，沉淀悬浮于500毫升蒸馏水中，冷冻干燥得到19.6克固定化米曲酰化酶干粉，简称DSA络合物。DSA络合物（19.6克）在37 水解15700微克分子乙酰-L-甲硫氨酸/小时，

30、在72 水解41600微克分子乙酰-L-甲硫氨酸/小时，而72 是DSA络合物最适温度。,2、以固定化米曲酰化酶于中间工厂生产L-色氨酸。酶柱连续工作50天（45 ）酶活力损失25-30%，其简单工艺流程见图16.6。,图16 三醋酸纤维素包埋酰化酶生产L-色氨酸流程 D1-储消旋酰化氨基酸容器; R-酶反应器;P-循环; D2和D3-储蓄器; E-蒸发器;S1和S2-离心器;D4-消旋化槽.,问题:,1.如何分离乙酰氨基酸和L-氨基酸? 2.如何将乙酰-D-氨基酸消旋? 某些L-氨基酸在水中溶解度远低于其酰化-D-氨基酸,将酶水解液浓缩则L-氨基酸结晶析出.过滤或离心后得到L-氨基酸结晶,再

31、经重结晶后可得旋光纯的L-氨基酸.也可用离子交换树脂将其分离.,第七章 酶反应器,1.什么是酶反应器? 2.酶反应器有哪些类型?它们各有何特点? 3.固定化对酶反应器有何优缺点? 优点:转化效率高,特别是当产物对反应有抑制作用时. 缺点:pH和温度难控制,易产生压降和压密.,第六章 酶分子的改造,一、酶分子改造的方法 1、化学修饰 ：L-天冬酰胺酶，PEG修饰可显著降低其免疫性，用于治疗急性淋巴性白血病。 2、传统诱变方法：Novo公司的中性纤维素酶和宽温幅退浆酶（-淀粉酶）（可达95摄氏度） 3、体外定点突变（1）PCR（2）化学合成+DNA聚合酶 合理设计和非合理设计,定向进化：酶分子的定

32、向进化是模拟自然机制（随机突变、基因重组和自然选择）从一个或多个已经存在的亲本酶基因出发，在体外经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶基因库，并定向选择或筛选出所需特性的酶,（1）易错PCR （2）DNA改组 （3）基因家族之间的同源重组 （4）外显子改组新的蛋白,1）易错PCR：高Mg2+加Mn2+，dNTP比例 枯草杆菌蛋白酶经易错PCR进化后筛选到的一株突变体在60%DMF中活性是天然酶的256倍 2）DNA改组：正突变基因库，DNase I片段化，重聚PCR，筛选正突变子水母的绿荧光蛋白经3次循环得到的突变体的荧光强度提高45倍 3）基因家族之间的同源重组：利用基因家族中各基因的千百

33、万年的进化成果，限制了有害突变，减轻了筛选难度。例如：从4个同源基因重组得到的头孢菌素酶S851对头孢羟羧氧胺抗性比野生的提高了270倍 4）外显子改组：在体外将不同真核基因的外显子进行重组装而形成新的蛋白质。例如：涉及纤溶和血凝的蛋白酶（纤溶酶，凝血酶，尿激酶，蛋白质C，X因子等）都含有类似胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶结构域，这表明它们是由独立的外显子组装进化而来。 5）杂合酶,第七章 酶的应用,一、淀粉酶 1、-淀粉酶的作用：从分子内部切开-1，4糖苷键不能切开-1，6键，也不能切开-1，6附近的-1，4键，糊精 2、糖化酶（葡萄糖淀粉酶）：从非还原端依次切开-1，4或-1，6键 1）3040%

34、淀粉浆，PH6.06 .5 2） -淀粉酶，8590 ，45min糊精 3）5560 ，PH4 .55 .0糖化酶（或固定化糖化酶）48h 4）分离纯化精制葡萄糖 5）葡萄糖异构酶PH 6 .5 7.0，MgSO4,6070 果葡糖浆 6）脱色，精制，浓缩果葡糖浆,3、-淀粉酶用于纺织品的上浆、退浆 化学法退浆：90100 ，1112小时；退浆率60% 酶法退浆：6065 ，0 .51小时，退浆率 85% 纺织品在漂白、印染之前，需将附着在其上的浆料除去,4、异淀粉酶的特点是能够切开支链淀粉型多糖分支处的-1，6糖苷键，从而使支链淀粉转变为直链淀粉，直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的

35、特性。 *豆类直链淀粉含量高。 *一般谷物淀粉之中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉为80%。,5、饴糖的生产： 传统方法：利用麦芽中-淀粉酶和 -淀粉酶，将糖化成麦芽糖浆，即为饴糖。饴糖的韧性好吸水性低，广泛用于糖果、糕点等食品加工中。 饴糖还可用-淀粉酶、 -淀粉酶来生产。若在加入 -淀粉酶进行糖化的同时，添加一些异淀粉酶，则可生产出麦芽糖含量更高的饴糖。,6、发酵原料的处理： 1）发酵工业大多数以淀粉为主要原料，有些会有纤维素 2）有些微生物不含淀粉酶等或纤维素酶；例如：酒精、甘油、乳酸、氨基酸、和苷酸等发酵所用的酵母或细菌一般都不能直接利用淀粉进行发酵 3）用-淀粉酶、糖化酶处理或纤维

36、素酶处理 Glucose 7、助消化剂：治疗消化不良和食欲不振,二、果胶酶的应用,1、果胶酶是指分解果胶质的多种酶的总称。果胶质主要是由D-半乳糖醛酸以-1，4糖苷键连抽形成的直链状聚合物 2、用于果汁加工：水果中含有大量的果胶，不利于榨汁、过滤，尤其是导致果汁不易澄清，用果胶酶处理则可解决这一问题 3、麻料脱胶：麻类植物均含有良好的纤维，这类纤维与纤维素、果胶、木质素等结合在一起，首先要脱胶,三、葡萄糖氧化酶,1、蛋白加工：蛋白质产品中的葡萄糖易与游离氨基相结合而褐变，变味。 2、血糖检测：原理： 葡萄糖氧化酶 C6H12O6+H2O+O2 C6H12O7+H2o 过氧化氢酶 H2O2 H2

37、O+O O+邻联甲苯胺 邻联甲苯胺 （无色，还原型） （氧化型，兰色）,下列葡萄糖浓度和尿糖试纸显色的关系： 葡萄糖浓度 颜色 0.1% 粉红色 0.2% 浅玫瑰色 0.5% 玫瑰红色 1.0% 玫瑰紫色 2.0% 紫色,四、过氧化氢酶用途,1、纺织品的漂染 2、制造检测Glucose的试纸 3、牛奶等的消毒 4、隐形眼镜的消毒 5、橡胶成型，塑料及多泡性黏合剂 6、和葡萄糖氧化酶联合使用用于食品加工,产品使用方法： （1）在用双氧水将纺织品氧漂后，放掉用过的漂液； （2）放入冷水清洗后，将水放掉； （3）加入冷水至适合染色的浴比； （4）建议调节pH7左右和温度35左右； （5）按0.030

38、.12 g/L的比例加入本产品，然后，运转1530分钟； （6）作用完后，可以检测织物或缸中双氧水是否被完全分解除去； （7）继续在同浴中进入染色工序。,使用本产品具有以下优点： 节约用水：生物除氧工艺只需要一道冷洗，甚至可以不用水洗而直接与染色工序同浴，这样可以节约大量的水资源。每吨布至少可以节约30吨水，按每吨水2.2元算，可以降低成本66元。 节能降耗：生物除氧工艺无需热洗，而且工艺时间短，这样可以节约电和汽。每吨布至少可以节约电45度，节约汽2.1立方，按每度电0.8元和每立方汽60元算，每吨布可以节约成本162元。 增加产量：和传统工艺相比，生物除氧工艺大大缩短了工艺时间。每吨布至少缩短220-100=120分钟。这样，在相同的时间和生产条件下，氧漂生物除氧工艺可以大大增加产量。 安全染色：使用传统工艺不易将过氧化氢除尽，而生物除氧工艺可以在短时间内彻底将残留的过氧化氢除尽，从而使得染色更安全，染色质量稳定。 提高布的质量：由于生物除氧工艺缩短了工艺时间，所以，可以减少布面因长时间在缸内运转而起毛，提高布的质量。 减少排污：由于生物除氧工艺用水量少，这样就减少了污水排放量，从而可以节约污水处理费。 绿色环保：过氧