《STR发展及应用》PPT课件.ppt

1、STR及其法医学应用,蔡福营 2007.2.8,一、 STR研究发展过程,人类基因组遗传标记发展过程,第一代遗传标记 RFLP 第二代遗传标记STR 第三代遗传标记SNP,用于个体识别的遗传标记的发展,1985,1990,1994,1996,1998,2000,2002,1992,Capillary electrophoresis of STRs first described,First STRs developed,FSS Quadruplex,First commercial fluorescent STR multiplexes,CODIS loci defined,STR typin

2、g with CE is fairly routine,Identifiler 5-dye kit and ABI 3100,PCR developed,PowerPlex 16 (16 loci in single amp),2006: DNA is an important part of the criminal justice system,2004,2006,Y-STRs, Justice for All Act ($1B over 5 years),Multiplex STRs,mtDNA,法医领域STR发展前景,

3、/nij/pubs-sum/183697.htm,美国国家司法局（national institute of justice）调研报告2000年11月份 评估DNA证据在未来 2, 5, and 10 years的发展前景 结论 STR typing is here to stay for a few years because of DNA databases that have grown to contain millions of profiles,法医学遗传标记的发展方向,提供更多信息的STR检测试剂盒（新的位点和其它生物学特征） miniSTR（迷你STR，长度较短，100bp左右

4、） SNP（与个体特征相关如肤色、毛发等的单核苷酸多态性位点）,二、 STR生物学特征,STR，short tandem repeat,短串联重复序列，微卫星（microsatellite），SSR (simple sequence repeat) 结构特征：序列重复，分为简单重复（simple）和复杂重复（complex） 分布于基因之间 STR基因座命名原则,STR是重复单位长度为2-6核苷酸的重复DNA序列,Dinucleotide (CA)(CA)(CA)(CA) Trinucleotide (GCC)(GCC)(GCC) Tetranucleotide (AATG)(AATG)(AA

5、TG) Pentanucleotide (AGAAA)(AGAAA) Hexanucleotide (AGTACA)(AGTACA),These categories were first described by Urquhart et al. (1994) Int. J. Legal Med. 107:13-20,STR 重复复杂程度分类,STR在人类基因组中分布广泛,HGP带来更多STR认识 目前被鉴定出的4核苷酸重复超过20，000个(Collins et al. An exhaustive DNA micro-satellite map of the human genome usi

6、ng high performance computing. Genomics 2003;82:10-19) 整个基因组中STR数量可能超过100万！ (Ellegren H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Rev Genet 2004;5:435-445). STR占整个人类基因组序列的3 (Lander et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409:860-921).,STR命名原则,国

7、际法医血液遗传学会（International Society of Forensic Haemogenetics, ISFH）1994,1997年提出命名原则 DNA链的选择（编码区和非编码区） 主型选定和等位基因命名,5-GGTTATTATTATGG-3 5-GGTTATTATTATGG-3 ,经典STR检测分析方法,设计位点特异性的引物，用PCR方法扩增得到STR片段 电泳检测扩增产物长度，并与allelic ladder对比 检测方法：PAGE（银染）荧光标记（测序仪、遗传分析仪）,基于STR长度不同来分辨,Multiplex PCR 多重/复合PCR,复合扩增的优势： 一次反应获得更

8、多信息量 降低成本，减少工作量，提高效率 模板需求量低,在同一反应体系中加入两对或更多引物，同时扩增得到,复合扩增的难点： 多对引物相互作用 反应条件一致 非特异性产物,荧光标记的分析方法,毛细管电泳图谱,三、STR分型中经常遇到的现象,Stutter 影子带 不依赖模板的加A作用 Off ladder的微变化等位基因 三等位基因（Tri-allele） 无效等位基因（Null alleles） 遗传突变（Mutation）,影子带 stutter,通常比主带少一个重复单位，由于滑动复制引起（也可以见到多一个） 重复单位越大，stutter越低（2345） 重复长度越长，stutter越高 S

9、tutter产量依次减小（主带12） 导致混合样本分型困难,影子带的产生(图片改为gene8),True allele (tetranucleotide repeat),n-4 stutter product,n+4 stutter product,Insertion caused by slippage of the copying (top) strand,Repeat unit bulges out when strand breathing occurs during replication,Deletion caused by slippage on the copied (bott

10、om) strand,Occurs less frequently (typically 2%) often down in the “noise” depending on sensitivity,Typically 5-15% of true allele in tetranucleotide repeats STR loci,不依赖模板的加A作用,Taq polymerase具有不依赖于模板在扩增产物的3末端加一个核苷酸（通常是A）的性质。具有高保真性的Taq酶例外。 反向引物的5端如果是G，可以增加加A的效率，也可以添加一个6核苷酸的tail PCR反应程序最后60度或72度保温154

11、5分钟 酶活力不够，可能导致加A效率低，出现双峰现象，（如：过量模板可能导致，体系中含有反应抑制物等）,5末端核苷酸对加A效率的影响,Promega includes an ATT sequence on the 5-end of many of their unlabeled PP16 primers to promote adenylation see Krenke et al. (2002) J. Forensic Sci. 47(4): 773-785 /biotech/strbase/PP16primers.htm,Figure 6.5,

12、 J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,过量模板可能导致加A不完全,Microvariant off ladder现象,重复次数不是基本重复单位的整倍数 或者序列跟基本重复单位不同或者这两者同时存在 非整倍重复的等位基因命名方法：完整重复数点部分重复数 (Bar et al. Int. J. Legal Med. 1994, 107:159-160) 例子: TH01 9.3 allele: TCAT4 -CAT TCAT5,三等位基因（Three-Peak Patter

13、ns）,类型2,三个峰高度相似,主要发生于TPOX and D21S11,类型1,两个峰高度之和与第三个峰高相同,D18S51,主要发生于D18S51,TPOX,Clayton et al. (2004) A genetic basis for anomalous band patterns encountered during DNA STR profiling. J Forensic Sci. 49(6):1207-1214,1137号样本GE16A检测结果,STRBase中的微变化和三基因案例,Off-Ladder Alleles,Tri-Allelic Patterns,http:/w

14、/biotech/strbase/var_tab.htm,Currently 328 at 13/13 CODIS loci + F13A01, FES/FPS, Penta D, Penta E, D2S1338, D19S433,Currently 80 at 13/13 CODIS loci + FES/FPS,Null alleles（无效等位基因）,样本DNA中含有该等位基因，但是由于没有被扩增和检测到，由于引物结合部位发生突变导致。 能够导致杂合子表现为纯合子，影响了DNA数据库比对 不同引物体系检测同一样本可能得到不同结果 新的STR检测试剂盒在应

15、用之前需要与已有产品进行大量的比对试验 Goldeneye16A 与Identifiler和PowerPlex16 比对目前没有发现这一现象,*,*,8,8,6,6,8,Allele 6 amplicon has “dropped out”,Imbalance in allele peak heights,Heterozygous alleles are well balanced,引物结合部位发生突变对扩增的影响,没有突变,结合位点3端突变 (allele dropout),结合位点中部突变,Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Editi

16、on, Figure 6.9, Elsevier Academic Press,遗传突变 mutaiton,无突变时遗传规律,父系突变,图谱为某市公安局06Q248号亲子鉴定三联体样本D8S1179位点,父,母,子,等位基因由亲代向子代遗传过程中不遵循孟德尔遗传定律,突变特点,突变普遍存在，发生在生殖细胞减数分裂过程中 突变率通常为1/1000减数分裂 父系突变通常高于母系突变 VWA, FGA, and D18S51突变率最高 TH01, TPOX, and D16S539突变率最低,商业化STR分型产品,ABI公司（美国），国内市场占有85左右，国际？ Promega公司（美国），国内市场

17、占有15左右 其他外国公司（德国、澳大利亚） 公安部第二研究所（物证鉴定中心） 江西中德生物 珠海科登（codon）?,目前研发的公司和机构,13个CODIS核心 STR Loci 及其染色体定位,CSF1PO,D5S818,D21S11,TH01,TPOX,D13S317,D7S820,D16S539,D18S51,D8S1179,D3S1358,FGA,VWA,AMEL,AMEL,主流产品STR位点比较,11 CODIS(TH01TPOX),Amel,D2,P E,D6,ABI ID,PP16 GE16A,DNA Typer15,11 CODIS(TH01TPOX),Amel,D2,D19

18、,D6,D12,ABI China,Goldeneye 16A,FAM,HEX,TMR,Promega PP16 kit,FAM,JOE,TMR,D5 155-205,D13 205-250,D7 251-300,D16 260-300,CSF 300-350,D2 305-370,FGA 210-360,D8 120-180,D12 215-275,A,Vwa 151-215,D3 100-150,D6 120-200,D21 185-250,D18 280-360,D19 100-150,ABI China kit,FAM,NED,VIC,JOE,DNA Typer15,D5 120-165,D13 155-190,D7 240-280,D16 255-300,FGA 330-400,CSF