2010DNA重组与克隆讲授.ppt

1、DNA重组与克隆,第 六 章,DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合称遗传重组或或基因重排。 重组产物称为重组体。 基因重组主要发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。（形式多样） 重组与进化关系密切，增加群体的遗传多样性，利于突变的优化组合。,DNA重组,接合作用 (conjugation),转化作用 (transformation),转导作用 (transduction),#转 座 (transposition),#同源重组 (homologous recombination),#位点特异的重组(site-specific recombination),异常重组,发生在同源序列间的重组称

2、为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。,6.1、同源重组,Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤,两个同源染色体DNA排列整齐 一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体 通过分支移动产生异源双链DNA（立体异构） Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体

3、含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,Holiday中间体,目 录,片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。,拼接重组体（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。,5,3,5,3,5,3,5,3,片段重组体,拼接重组体,目 录,分支移动的过程伴随着DNA 的修复,同源重组是减数分裂的原因。 同源重组是由于碱基间的精确配对实现的,异源双链与基因交换,同源重组时会产生异源双链，

4、从而发生基因交换。 减数分裂后分离：（对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因校正过程称作基因转换） 基因转换频率在非对称异源双链区较高。 基因转换也可以在有丝分裂时姐妹染色体的等位基因间、有丝分裂与减数分裂时同一条染色单体上非等位重复基因之间发生,Holliday 模型提出了同源重组的基本模式，但对于基因重组具体细节，异源双链的形成细节不清楚。 在Holliday基础上提出了单链断裂模型和双链断裂模型，两个模型的区别在于解释重组期间DNA的修复的具体过程不一样。有供体受体之分。（受体：发生链断裂的分子P138-139）,细菌的基因转移与重组,低等生物也可以以转化、转导、结合等多种方式实现细

5、胞间的基因转移。 具体方式：接合、转化、转导、细胞融合。 外源基因的命运：降解、暂时保留、与内源基因置换、整合。,一、接合作用（conjugation) 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至 另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。,F 因子编码表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA转移通道蛋白等、,F 因子可以与细菌染色体发生交叉连接而重组整合入细菌染色体,二、转化作用（transformation) 通过自动获取或人为地供给外源DNA， 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。,感受态细胞,高浓度钙可以诱导感受态,例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一

6、细菌摄取。,三、转导作用（transduction) 当病毒从被感染的细胞（供体） 释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间 的DNA转移及基因重组。,图 15-3 转导作用,转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞 之间的DNA转移及基因重组,转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用,转导(transduction),*转染(transfection),转染是转化的一种特殊形式。 由transformation（转化）和 infection（感染）两词构成。 原指将噬菌体、病毒或

7、以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。 将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫转染。,细菌的细胞融合,由于细胞质膜融合导致的基因转移和重组。 （原生质体融合）,细菌的同源重组的酶学机制,1、RecBCD（外切核酸酶）和 Chi 位点,具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、 序列特异性的单链内切酶活性,单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点,RecBCD有固定切割位点,原核生物的重组酶学机制已经比较清楚,Chi 位点出现几率很高，是RecBCD的靶

8、位点,GCTGGTGG, RecBCD的识别和切割位点,a、 RecBCD结合在DNA的平 头末端（产生机制不清楚）,b、 外切、解链、移动 （ATP）,c、 兔耳状 loop 结构产生 再旋酶活性低于解旋酶活性）,d、 RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3方46NT处切 断单链（单链内切酶）, chi位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点 E.coli 含 1000 个、Euk.,e、 RecBCD 切割产生3单链末端,2、RecA 蛋白,（1） 活性,a、 RecA 有单、双链 DNA 结合活性,b、 RecA 有 NTPase 活性（底物差异活性） 与单链 DNA 结

9、合时活性最大-依赖于 DNA,c、 RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力，即联会同源 DNA （但其靶 DNA 必须有缺口结合DNA）,RecA引发链侵入模型,RecA引起的链交换和Holliday结构的生成,（2）RecA 蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段,a、 联会前阶段（缓慢） RecA 与单链结合,b、 单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子 Holliday（5侵入）,c、 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA 反应结束时，RecA 结合到双链上, 其中单链同化有固定的方向 入侵单链进入的方向是53， 双链 DNA 的互补链是3

10、5, RecBCD 和 RecA 的共同作用,RecBCD产生游离单链- RECA 因子接到重组反应,3、原核同源重组的其它蛋白,需要 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的产物,a、 RuvA 识别 Holliday 结构的连接点,b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（ATPase 1020bp/s）,c、 RuvC 核酸内切酶-专一性识别 Holliday 结构的连接点 体外切段连接点以拆分重组体, E.coli 重组的各阶段 （损伤修复）,损伤DNA复制产生缺口,RecA链交换,第二次链交换,DNApol通过DNA合成填满缺口,RuvA,B分枝迁移,RuvC切割Ho

11、lliday连接点,真核生物同源重组机制自学,7.2、位点专一性重组（ site-specific recombination）,1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间 的重组（包括一些基因表达调节、发育过程中DNA重排）,噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组,2、特征：, 在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接 -产生精确的DNA重排, 都具有整合作用的两个基本特征,a、 典型的保守性重组-交换是相互的和保存原先的DNA,b、 发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上,二、phage的整合与切除（溶原和裂解状态）,1、实现机制：,均是通过-细菌DNA和

12、DNA上特定位点之间的重组,2、特定位点-附着位点（attachment site att）, E.coli attB 含BOB三序列 23bp, phage attP 含 POP三序列 240bp, 核心序列 “O”完全一致 （同源部分） -位点特异性重组发生的地方, B,B,P,P-臂,3、整合过程, 整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB）, 整合位点-attB、attP 切除位点-attL、attR, 整合过程需要整合酶 （integrase Int）（编码） 和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用,溶源性细菌 (ly

13、sogen),溶菌周期 （lysis）,原噬菌体,4、整合分子机制, 核心序列O全长15bp，富含A-T, 发生在O内的重组交换位点相距 7bp, 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同), attP位点的负超螺旋为重组所必须-加强了Int和IHF的亲和力 -高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构, Int结合 -核心序列的反向位点（切割位置） -结合在att臂上（臂与核心区靠近）,Xis, 整合体及其作用 整合体（intasome）- Int和IHF结合到attP时的复合物, 整合体捕获attB 说明- a、attB和attP的最初识别靠Int 识别两序列的

14、能力 b、两序列的同源性在链交换时为 重要因素, Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分, 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交,例（二）细菌的特异位点重组,沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变,hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。,沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变,P197,7.3、转座成分概述,1、转座子(元)或转座元件(transposon or

15、transposable element): 基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体）,转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分确切）,2、发现和发展, 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变,玉米籽粒糊粉层色素不稳定遗传机理,跳跃基因（jumping gene）, 1947 冷泉港实验室（美） Barbara McClintock,a) 不依赖供体序列与靶位点间序列的同源性,b) 转座不是简单的转移，涉及转座子的复制,Hotspots

16、(热点) Regional preference ( 在3kb区域内的随机插入),d) 某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性 （免疫性）,e) 靶序列在转座因子两侧会形成正向重复,f) 转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应,3、转座重组的特点,c) 转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）,二、Prok.转座子种类, 两种类型： 简单转座子（simple transposon） （插入序列 insertion sequence IS ） 复合转座子（composite transposon）, 共同特征： a）两端有2040bp的IR(反向重复序列) b）具有编码转座酶

17、（transposase）的基因,1、插入序列（最简单的转座子称作插入序列）, 最简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分, 命名： IS编号（鉴定类型） 长度 7002000bp, 特点： a）两端IR为转座酶的识别位点（突变） b）插入靶位点后会出现靶位点的正向重复（39bp）, IS 可以正反方向插入到DNA（宿主、质粒或某些噬菌体）， 常对插入位点后面的基因表达功能产生极性效应,a) Tn / TnA family,l 具有IR、转座酶基因、 调节基因（解离酶）、抗抗生素基因,l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) T

18、n5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR),2、复合转座子, 两种类型,b）两端重复序列为IS的复合转座子,e.g. IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子,transposition, 当两个IS组件相同时，其中任一个都可行使转座功能, 不同时，主要依靠一个, 两侧的IS既可以是IR，又可以是DR状态 （IR多）,3 转座噬菌体 Mu phage （巨型转座子 ）,C repressor for A, B B 33 kd 与转座有关 A 70 kd 转座酶 U, S 毒性蛋白 attL, attR 与寄主同源，反向重复，转座必需 Gin G区倒位酶, 以E.coli为寄主的温和型噬菌体（溶源、裂解）, Mu的插入途径,a） 侵入的Mu在溶源化过程中任意插入寄主DNA （两侧各5bp的靶位点序列重复）,b） 进入裂解生长后，复制产生后代Mu DNA几乎全部插入寄主 DNA中，并可继续转座（形成寄主DNA和Mu的共合体），噬 菌体成熟时，切段共合体包装,三、转座子的转作机制及模式, 三种类型