酶学及酶工程课3章3节.ppt

1、酶学及酶工程,Enzymology and Enzyme Engineering,田维熙 教授 中国科学院研究生院,第三章 酶的结构与功能,第二节 酶的溶液构象测定（续）,2. 荧光光谱,荧光：某些带荧光基团的物质吸收特定波长激发光（excitation）能量，由基态跃迁到激发态。经内转换耗损部分能量后，再回到低能级，放出波长较大的光，称为荧光（emission）。产生荧光过程很快，约为108秒。停止激发光后荧光随之消失。激发光和荧光都有特定波长，激发光相对效率和荧光强度形成激发光谱和发射光谱。,电子能级跃迁,荧光分析法,对荧光光谱及其变化进行分析，可以用于活性测定，构象变化测定，简单结构测定

2、，微环境测定，必需基团测定等。 荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性强，样品量少，方法简单。 使用范围：有产生荧光的基团参与，一般是芳环，特别是稠芳环的基团。,荧光强度公式,荧光强度 FKI0（1eA） K：仪器常数，：量子产率，I0：激发光强度，A：样品吸光度 A较小时，可以近似为FKI0A。 A大到一定值时，F会随A增加而减少，产生浓度淬灭现象。 量子产率：表示物质发射荧光的本领，定义为发射量子数与吸收量子数之比。 一般用荧光强度相对值：F1/F21A1/2A2。 1为标准品，2为样品。,蛋白质的内源荧光,来自芳香族氨基酸，主要是色氨酸和酪氨酸。（280nm激发光，最大荧光在313nm（酪氨

3、酸）和350nm（色氨酸） A类蛋白无色氨酸，最大荧光发射波长304nm，来自酪氨酸，且位置不受大分子构象变化影响。 B类蛋白质含酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，最大荧光发射在320350nm范围，位置和量子产率都与环境有关，受构象影响。,蛋白质构象变化时表面酪氨酸和色氨酸发生变化，内源荧光强度和峰位会变化，从而可探测蛋白质的构象变化。,蛋白质的外源荧光,荧光染料可与蛋白质共价结合，使蛋白分子带上特定的荧光性质，称为荧光探针。其对环境极性很敏感，在非极性环境中荧光很强，在极性溶剂中很弱。由其在各蛋白质分子中的荧光峰位、谱宽及量子产率可探测结合区的极性，获得构象信息。 苯胺萘磺酸染料是常用的荧光探针，

4、氨基酸（蛋白质）结合后形成DNS氨基酸（dansyl氨基酸），具有相应荧光特性。,常用荧光探针,荧光标记探测构象变化,荧光分析（续）,荧光胺是用于探测氨基状态的荧光探针，可以和氨基酸迅速反应，灵敏度很高。 荧光素醋酸汞用于用于探测二硫键：在1mol/L的NaOH中其荧光被二硫键淬灭。 荧光标记蛋白质后，测定其荧光偏振可以了解和辅基、底物、抗原等的结合程度。结合越紧荧光偏振越大。也可以用于探测聚合和解离状态。,能量转移,带荧光基团的给体分子吸收能量后激发，无受体存在时发射荧光返回基态。附近有受体时可将能量转移给受体，受体激发后可能发射自己特征荧光，称敏化荧光；也可能放热不发荧光，称荧光淬灭。,转

5、移效率和两基团距离相关，可以测定分子（基团）间距离。,3. 园二色谱（CD谱）,园二色谱是利用不对称分子对左、右园偏振光吸光不同进行结构分析的方法。 蛋白质的二级结构：螺旋，折叠，转角，无规卷曲具有不同的对称性，因而可利用CD谱测定蛋白质的二级结构，从而也可测定构象变化。 互相垂直的平面偏振光，振幅相等位相差/2时合成为园偏振光，右手螺旋旋转的称右偏振光，左手螺旋旋转的为左偏振光。,右旋园偏振光的合成,左旋园偏振光的合成,振幅（强度）不同，频率相同的左右偏振光合成椭圆偏振光，椭园度的正切为椭园短轴和长轴之比。,园二色性的关系式,椭圆度： = 0.25（ AL-AR ）d A为偏振光振幅，d为介

6、质长度。 比椭圆度： = / c d C为介质浓度。 摩尔椭圆度： = M/100 = 3300 为偏振光吸收差。,园二色谱与二级结构,左、右园偏振光进入含不对称分子的光学活性物质时，被吸收程度不同，因而从介质出来的光是椭园偏振光。其吸收差和波长有关。 吸收差或椭园度可用园二色仪测定。椭园度与波长的关系称园二色谱，各种二级结构有不同的园二色谱和特征峰位，因而园二色谱可用于测定二级结构。CD谱对二级结构变化很灵敏，常用于监测构象变化。,蛋白质中各种二级结构具有各自的特征园二色谱,二级结构计算,单值法计算螺旋（残基百分比）： f=(208-4000)/(33000-4000) 全值计算二级结构：

7、f f fR 1 = f , + f , + fR ,R 假设一系列处的f，f，fR值，计算得到 对曲线，和测定结果比较，取拟合最好的数值。,蛋白质的构象变化造成二级结构改变时，园二色谱发生变化。从而可以测定去折叠（变性）和重折叠（复性）的状态和变化,4. 红外光谱(RTIR),蛋白质在红外区表现8个特征基团频率。,酰胺基团红外光谱,红外光谱用于分析蛋白质二级结构已进入定量阶段。 最常用于二级结构分析的是酰胺I带，位于16001700cm-1范围。 碳氧和氮氢间的氢键决定酰胺I带振动频率，反映特定二级结构。 1986年Byler和Susi用二阶导数和去卷积法分析，给出了各构象的特征酰胺I带位置

8、，确定了各子峰的归属。,水溶液中酰胺I带特征频率指认,重水中酰胺I带特征频率指认,水在酰胺I带有一定红外吸收，因此也用重水中的指认提供进一步依据。,去卷积谱和二阶导数谱,红外光谱:去卷积谱曲线拟合,多种二级结构振动吸收峰重叠形成宽峰，难以区分。利用去卷积技术于傅立叶变换红外光谱，可将其分解为多个子峰，定量分析各构象成分。,红外光谱:二级结构指认例,对肌酸激酶Holo-酶和Apo-酶的FTIR酰胺I带二级结构的指认结果。,第三章 酶的结构与功能,第三节 去折叠与重折叠研究,1. 蛋白质折叠机制研究,现代分子生物学基于以下的认识：一级结构决定高级结构，结构确定功能。即有了新生肽链就有相应的功能蛋白

9、。 新生肽链确定功能蛋白吗？应该是肯定的。否则DNA就不可能携带了全部遗传信息。但是新生肽链如何确定的功能蛋白，却不是想象的那么简单。很多时候新生肽链并没有正确折叠成功能蛋白。因而正确折叠也成为基因工程成功的一个技术关键。 这使折叠机制研究成为当前生物学热点之一。,折叠理论,早期的二态理论：蛋白质存在未折叠和全折叠两种状态，折叠态的能量最低，热力学规律使新生肽链只能迅速折叠成有活性的功能蛋白。适用于小型球蛋白。 中间态，无活性稳定态的发现打破了二态理论。在大量较大蛋白中发现了折叠中间态，如熔球态，有基本的三级结构，但较松散，无活性。产生了折叠的多态阶段理论。 进一步提出新生肽链功能蛋白应作为中

10、心法则的一个阶段的假说。,变性复性研究,由蛋白质生物合成开始研究折叠存在技术上的困难。 将功能蛋白去折叠再重折叠，又称变性复性，是当前研究蛋白折叠的主要方法。 目前认为，去折叠和重折叠遵循互逆的同一途径。变性成为研究折叠最简便的方法。 胍、脲、表面活性剂是最主要的完全变性剂。盐、有机溶剂、pH、高温等也作为变性方法应用。 协助复性方法包括控制温度、pH、速度，使用分子伴侣，渗压剂osmolytes等。,2.研究实例,动物脂肪酸合酶是一个典型多功能复合酶,荧光分析表现脂肪酸合酶的胍变性存在两阶段结构变化过程。,紫外差光谱，园二色谱研究也表现了两个构象变化阶段。 但在整体构象发生变化之前，该酶已不

11、可逆失活。,巯基暴露测定,肽链折叠和展开状态不同时，暴露在外的可作用巯基数目不同。测定可作用巯基是一个简单易行的实验，且可连续测定巯基的作用，因而可用于测定构象的变化，肽链的展开过程。 测定巯基采用DTNB，与SH很快作用： TNB-S-S-TNB + R-SH TNB-SH + R-S-S-TNB 产物TNB在412nm处有很强光吸收，而DTNB没有。在412nm测定光吸收即可测知可作用SH数，且可在作用过程中连续监测。需测定快速作用过程时还可应用stopped-flow等方法。 通常采用2个数量级以上过量的DTNB与酶作用。,巯基暴露实验表现该酶三级结构打开和其它方法测定的第一阶段整体构象

12、变化同步发生。,不可逆失活测定表明，该酶全反应的失活先于单独功能结构域的失活。,在很低胍浓度下该酶的全反应活性和两个单独还原中心活性同步被可逆抑制，且先于不可逆抑制的发生。,讨论,以上结果表明，FAS的胍变性为多阶段构象变化。按胍浓度由低到高，FAS的构象变化依次为：可逆抑制，全反应的不可逆失活，组成酶的不可逆失活，整体构象变化I，整体构象变化。可测定的变化阶段明显多于较小分子的核糖核酸酶，肌酸激酶等。 1. 可逆抑制。胍对FAS全反应及二个单独还原反应的可逆抑制程度相仿，表现了其抑制发生于组成酶的活性部位。测定表明抑制为非竞争性，可能是对活性部位构象的微扰造成的。,讨论（续）,2.全反应的不

13、可逆失活。该失活速度大大高于组成酶的失活，因此其失活不是由于活性部位不可逆构象变化造成的，很可能是由于复合酶整体的不可逆的构象变化造成各活性部位相对位置变化造成的。 3.组成酶的不可逆失活。全反应和单独还原反应胍失活的终态活性相似表明该失活的原因为活性部位的不可逆构象变化造成。,讨论（续）,4.整体构象变化I。此阶段巯基已基本暴露，紫外差光谱变化已基本到位，但CD谱变化还较小，表现此阶段三级结构已打开，二级结构还基本保持。 5.整体构象变化II。此阶段各项测定的变化值均已到位，二级结构已破坏，蛋白分子完全去折叠。此时胍的浓度大约为3mol/L。,讨论（续）,胍失活的FAS不能直接稀释复活，反映了FAS折叠和去折叠一样也是分阶段进行的，不同阶段进行不同部分